背景: 单克隆抗体广泛用于多种疾病的治疗，包括癌症，自身免疫性疾病和代谢紊乱，截止2024年6月24日，全球有近214种治疗性抗体药物已获批准或正在进行监管审查（关注公众号“迈思生物”，回复“Antibody”获取抗体药物信息）。与小分子药物相比，治疗性抗体药物一般对靶抗原具有较强的结合效力，提供了高特异性、高靶标占用率、低脱靶毒性的可能性。靶标结合是治疗性抗体发挥药理活性的必要条件，精确测量治疗性抗体的结合活性变化对于确定抗体早期可发展性评估中的潜在关键质量属性（CQAs）具有重要意义。

2024年7月2日先声药业研究人员在MAbs上发表了一篇名为“Early determination of potential critical quality attributes of therapeutic antibodies in developability studies through surface plasmon resonance-based relative binding activity assessment”的文章，研究人员开发了一种基于SPR的相对结合活性方法，该方法结合了结合亲和力和结合反应，能够以高精度和精密度确定抗体的相对结合活性。将基于SPR的相对结合活性方法应用于抗体可开发性评估的多项强制降解研究中。当前的可开发性评估策略在稳定性研究中提供了抗体结合活性的全面、精确表征，能够进行相关性分析并建立相对结合活性与质量属性之间的结构-功能关系。无需分离抗体变体，即可自信地确定给定质量属性对结合活性的影响。研究人员还确定了几种潜在的CQA，包括Asp异构化、Asn脱酰胺和碎片化。

基于SPR的相对结合活性方法概述

从活性角度来看，抗体样本可分为两个主要的亚群，即活性抗体和非活性抗体，其中活性抗体包括部分活性抗体和完全活性抗体。因此了解活性抗体的活性水平及其在检测样本中的丰度将使我们能够确定抗体的结合效力水平。基于SPR的结合动力学分析提供了多个抗体-抗原结合参数，包括结合速率常数ka、解离速率常数kd、平衡解离常数KD、最大结合响应Rmax和抗体捕获水平。在抗体捕获结合动力学分析中，KD常数已被广泛用于代表抗体结合强度，最大结合响应（Rmax）反映抗体结合能力。对于以参考标准归一化的测试样本相对结合活性评估，首先，对于测试样本的相对Rmax，通过相关的捕获水平对Rmax进行归一化，即归一化Rmax。相对KD反映抗体的相对结合强度，相对Rmax反映抗体的相对结合能力。因此，测试样本的相对结合活性由相对Rmax与相对KD相乘得出，其表征测试样本相对于参考标准的整体相对结合活性水平。基于SPR的相对结合活性方法为结合活性改变提供了三层表征：基于KD变化的降低，基于Rmax变化的损失， 以及同时考虑KD和Rmax的总体变更。

案例研究1：Asp26异构化导致mAb-A的结合活性显著降低

第一个案例涉及一种称为mAb-A的IgG4抗体，研究人员对mAb-A在微酸性pH 5.5和中性pH 7.4缓冲液中的热应力稳定性进行了研究。应用基于SPR的相对结合活性法在强制降解实验中评估了mAb-A的结合活性，发现微酸性和中性稳定性研究中，相对KD和相对结合活性均呈时间依赖性显著降低，而相对Rmax则呈轻度降低。表明mAb-A相对结合活性的改变主要与相对KD相关，这是通过降低结合亲和力实现的。

研究人员研究了与mAb-A相对结合活性改变相关的生物物理特性，基于质谱的肽图分析表明，在微酸性和中性稳定性研究中，Asp26和重链CDR1区的组氨酸异构化呈现出时间依赖性增加。

之前也有报导重链CDR2区域的Asp- his基序中出现了高异构化，显著影响了抗体结合活性。

研究人员发现Asp26异构化的增加和相对KD和相对结合活性的变化密切相关，Asp26异构化能显著影响mAb-A的结合亲和力。研究人员观察到相对KD和相对kd有明确的相关性，表明相对KD减少与解离率增加相关。研究人员鉴定了D26T突变体并在微酸性溶液中进行热应力测试。与mAb-A野生型（WT）相比，观察到D26T突变体的相对KD和相对结合活性略有降低，证实了Asp26异构化是导致相对KD降低的主要原因，并且在稳定性研究期间可显著影响mAb-A的结合活性。这些结果表明，重链Asp26异构化可通过提高解离率，显著影响mAb-A的结合活性，因此被认为是mAb-A抗体开发的潜在CQA。

研究人员对基于SPR的相对结合活性法和基于SPR的相对活性浓度法进行了直接比较，建立了经典的基于SPR的mAb-A活性浓度检测方法，并在微酸性和中性稳定性研究中检测到相对活性浓度的轻微变化。发现所有的相对活性浓度都大于95%，证明了活性浓度方法不能监测解离率的变化。

案例研究2. 碎片化导致mAb-B的结合活性显著下降

第二个病例研究涉及称为mAb-B的IgG1抗体，研究人员对mAb在中性pH 7.4和微酸性pH 6.0下的热应力稳定性进行了研究。发现与案例1中一样，中性和微酸性稳定条件下，相对KD和相对结合活性均呈时间依赖性显著降低，而相对Rmax则呈轻度降低。mAb相对结合活性的改变主要通过降低结合亲和力与相对KD相关。通过研究与与mAb相对结合活性变化相关的质量属性，nrCE-SDS分析显示，在中性和微酸性稳定性研究中，片段数呈时间依赖性增加。

研究人员通过MS分析，测量了片段的分子量，并定位了轻链（LC）CDR3区天冬酰胺93和脯氨酸94之间的剪切点。研究人员也发现片段的增加与相对KD和相对结合活性表现出良好的相关性，相对KD与相对kd有明确的相关性，表明解离率的增加是相对KD减少的原因。轻链CDR3区域的Asn-Pro片段可通过减少KD，提高解离率，显著影响mAb-B的结合活性，并被认为是mab抗体开发的潜在CQA。

研究人员制备了N93L突变体并在中性溶液中进行了热应力研究。与mAb-B WT相比，相对结合活性分析表明，N93L突变体的相对KD和相对结合活性均有轻微降低。这证实了Asn-Pro碎片化是造成相对KD降低的主要原因，并且可能在稳定性研究期间显著影响mAb-B的结合活性。

案例研究3. Asp53异构化导致mAb-C结合活性丧失

第三个病例研究涉及一种与IgG4 Fc抗体融合的VHH，称为mAb-C。研究人员对mAb-C在微酸性pH 5.5缓冲液中的热强迫降解进行了研究。在稳定性研究中应用了基于SPR的相对结合活性法来监测mAb-C的结合活性。发现相对Rmax和相对结合活性呈时间依赖性显著降低，而相对KD呈轻度降低。相对Rmax的降低表明部分mAb-C抗体在热应力作用下完全丧失结合活性。肽图分析表明，Asp53和甘氨酸在CDR2区域的异构化呈时间依赖性增加。

Asp53异构化增加与相对Rmax和相对结合活性有明确的相关性，Asp53异构化的增加量与相对Rmax的降低水平相等，表明Asp53异构化完全消除了抗体结合活性。Asp53异构化可能导致稳定性研究期间结合活性丧失，并被视为mAb-C抗体开发的潜在CQA。

研究人员设计G54A突变体，并在微酸性缓冲液中进行了热稳定性研究。与mAb-C WT相比，相对结合活性分析显示，对于G54A突变体，相对Rmax和相对结合活性呈时间依赖性轻度降低。肽图分析发现，在该突变体中，Asp53异构化略有增加，Asp53异构化水平的增加与相对Rmax水平的降低基本相等。这证实了Asp53异构化导致相对Rmax降低，并在稳定性研究中完全削弱了mAb-C的结合活性。

案例研究4. 低丰度Asn33脱酰胺被确定为mAb-D的潜在CQA

第四个案例研究涉及一种名为mAb-D的IgG4抗体。研究人员对mAb-D在微酸性pH 5.5和中性pH 7.4缓冲液中的热强迫降解进行了研究。利用基于SPR的相对结合活性方法，观察到无论在微酸性还是中性稳定性研究中，相对KD、相对Rmax和相对结合活性均呈现出时间依赖性的降低趋势。

研究人员通过研究与mAb-D的相对结合活性变化相关的生物物理性质，肽图分析表明，在微酸性和中性稳定性研究中，Asn33和轻链CDR1区的丝氨酸脱酰胺均呈现出时间依赖性增加。

研究人员分析其相对KD，相对Rmax和相对结合活性的相关性，结果发现Asn33脱酰胺的增加与所有三种相对结合活性指标密切相关，并且相对KD与相对kd有明确的相关性，相对KD的减少与解离率的增加相关。

为了证实Asn33脱酰胺对mAbD结合活性的影响，研究人员在pH 9.0的缓冲液中进行了高pH胁迫稳定性研究。Asn33脱酰胺显著增加，而相对KD、相对Rmax和相对结合活性显著降低。天冬酰胺脱酰胺反应会产生三种主要产物：琥珀酰亚胺、天冬氨酸和异天冬氨酸。研究人员推测Asn33脱酰胺通过不同的脱酰胺变体影响抗体结合亲和力和结合反应，并导致结合活性的显著降低。在稳定性研究中，轻链Asn33脱酰胺对mAb-D的结合活性有明显影响，因此研究人员将视为mAb-D抗体开发的潜在CQA。

基于SPR的相对结合活性方法作为潜在的质量控制释放试验

研究人员对基于SPR的相对结合活性方法进行了方法鉴定研究，并确定了分析程序鉴定的关键参数，包括准确度、精确度、灵敏度、稳健性和系统适用性。研究人员对来自mAb-A、mAb-B和mAb-C的五组稳定性样品在约40天内进行了9次基于SPR的相对结合活性分析。结果表明，基于SPR的相对结合活性方法具有合适的准确度、较高的重现性和良好的稳定性，支持了基于SPR的相对结合活性方法作为质量控制放行和稳定性测定的潜力。

总结与展望

在抗体药物开发的早期阶段，精确测量抗体结合活性的变化对于识别潜在的关键质量属性（CQAs）至关重要。在此，报告了一种基于传统抗体捕获结合动力学模式的新型SPR分析程序，该程序结合了结合亲和力和结合响应，使我们能够以适当的准确度和高精度确定抗体的相对结合活性。通过这种方法，在抗体开发能力评估中确定了多种潜在的CQAs，包括片段化、Asp异构化和Asn脱酰胺化。这些潜在CQAs可能通过增加解离率来影响抗体结合亲和力，导致结合活性降低；或者通过损害抗体与抗原的结合，导致结合活性丧失。SPR相对结合活性方法易于使用，无需复杂的检测方法开发，适用于大多数治疗性抗体，可以应用于抗体开发的多个阶段。SPR相对结合活性方法代表了在开发阶段评估治疗性抗体相对结合活性的一个重大进展，这种方法采用易于使用的抗体捕获结合动力学模式，可以应用于大多数治疗性抗体。