背景：
乙嘧酚作为一种典型的嘧啶杀菌剂，50多年来被广泛用于防治各种水果和蔬菜的白粉病。过量使用乙嘧酚会导致主要农产品作物表皮残留积累达到0.012-0.061 meq/kg，人类长期接触乙嘧酚可能导致血尿素浓度升高、相对肝脏重量增加，甚至尿失禁和甲状腺炎，2-14岁儿童因长期接触乙嘧酚会面临更大的非致癌健康风。
（数据来源 hen Z, et al. Chemosphere. 2023）
目前针对乙嘧酚的检测主要基于液相色谱、串联质谱、气相色谱-串联质谱法，但这些方法需要昂贵设备、专业人员和耗时的样品制备，因此，迫切需要一种现场、高通量快速检测，高度灵敏且可靠的分析方法来检测农作物和环境中的乙嘧酚残留。
（数据来源 Lei X, et al. J Hazard Mater. 2024）
最近，中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所团队在J Hazard Mater上发表了最新研究成果：获得一种针对乙嘧酚的新型单克隆抗体，通过分子模拟研究了重组抗体识别乙嘧酚新型半抗原结构机制，并开发了间接竞争性酶联免疫吸附测定(ic-ELISA)方法，快速便捷检测真实样品中的乙嘧酚。
半抗原设计：
对于小分子化合物，引入一个合适的间隔臂，可以确保特征基团最佳地暴露于免疫系统，同时保持与载体蛋白偶联距离，研究人员对乙嘧酚间隔臂采用了两个相反的方向，并据此设计了两个半抗原结构hapten01和hapten02。表面静电势分析显示在半抗原02中N6、N7和O16暴露更为突出，促进免疫系统识别抗原。因此，选择了半抗原02作为合成的半抗原分子。
制备免疫原&筛选原：
小分子具有抗原性，但缺乏免疫原性，为了诱导免疫原性，小分子化合物必须与载体蛋白偶联，形成完整的抗原。采用活性酯法将乙嘧酚半抗原Hapten02与载体蛋白BSA和OVA结合，合成了完整的抗原。Hapten-BSA和Hapten-OVA在各自的最大吸收峰处的分子量分别为75991.440和47756.602。这些值超过了BSA/OVA标准品的最大吸收峰（分别为67510.359和44721.036），表明半抗原与BSA/OVA表面的成功耦合。
单抗开发与验证：
采用杂交瘤技术经细胞克隆和筛选，选择单克隆细胞株14G5F6进行后续实验，该抗体的重链属于IgG1同型，而轻链属于kappa型，经过扩增和测序获得mAb-14G5F6可变区的氨基酸基因，进一步整合到表达载体PSTEP2-Mouse-IgG1-CH/κ-CL中重组表达获得rAb-14G5F6。mAb-14g5f6的IC50值为1.35μg/L，检测范围(IC20~IC80)为0.34~6.26μg/L，相关系数(R2)为0.999，结果证明了半抗原结构的合理性。rAb-14G5F6的IC50值为1.15μg/L，检测范围(IC20~IC80)为0.27~4.89μg/L，相关系数(R2)为0.999，表现出与亲本mAb-14G5F6一致的识别敏感性。
抗体结合动力学SPR测定：
单循环SPR筛选，在60 s的结合过程中，乙嘧酚能迅速与芯片上的mAb-14G5F6和rAb-14G5F6结合，而其他类似物则表现出弱结合或无结合；在解离过程中，乙嘧酚与芯片的解离相对较慢，而其他类似物解离迅速，表明抗体对乙嘧酚的结合亲和力大于其他类似物。多循环动力学检测mAb-14G5F6的KD亲和力常数为5.45×10-10mol/L，而rAb-14G5F6为5.71×10-10mol/L，两种抗体对乙嘧酚表现出特殊的特异性和亲和力，与ic-ELISA结果一致。
免疫分析方法开发：
利用rAb-14G5F6抗体建立针对灌溉水和草莓样品中乙嘧酚的免疫分析方法。rAb-14G5F6的ic-ELISA方法最低检测限(LOD)值为0.036 mg/kg,远低于欧盟设定的草莓最大残留量限值（0.3 mg/kg），可满足草莓乙嘧酚的监测要求。与液相质谱/质谱检测结果相比，相关曲线斜率值(R 2 )接近1，表明基于rAb-14G5F6的ic-ELISA可靠性和准确性。
抗体分子机制：
基于同源建模原理，预测了rAb-14G5F6的抗原结合区域。乙嘧酚N6和N7周围的氢原子，以及O16和嘧啶环，是乙嘧酚抗体特异性识别的关键：乙嘧酚的N6和N7上的氢原子作为氢供体形成传统的氢键，C9上的氢原子作为氢供体，抗体CDRH3中的GLY108作为氢受体形成碳–氢键，此外，CDRL3中的GLY107作为氢供体，乙嘧酚上的O16作为氢受体形成碳–氢键这些力量共同作用，形成稳定的抗体-乙嘧酚复合物。在CDRH3的ASP（H114）和乙嘧酚的中心嘧啶环之间建立了强大的离子键，加强了抗体对乙嘧酚“快速结合和缓慢解离”的特征动力学模式。
小结：
在本研究中，研究人员成功地开发了一种基于新型重组抗体高通量、低成本的小分子乙嘧酚免疫检测方法，填补了乙嘧酚快速检测方法的空白，而重组抗体在哺乳动物细胞中的表达保留了原始单抗的特殊特征，包括亲和力、特异性、耐受性和实际的样本检测能力。
