在生物医学研究和临床应用的前沿，蛋白质工程和生物分子标记技术正发挥着举足轻重的作用。然而，传统的蛋白质标记和偶联方法常常受限于非特异性结合、低稳定性和低效率等问题。SpyTag-SpyCatcher系统的出现，以其卓越的高特异性、简便的操作流程、不可逆的共价连接特性，以及模块化的组装能力，为这些挑战提供了创新的解决方案。这一系统不仅在构建复杂蛋白质结构和功能单元方面展现出巨大潜力，而且在新药开发、疫苗研制、工业催化剂和疾病诊断等多个领域中发挥着至关重要的作用。本文将详细介绍SpyTag-SpyCatcher系统的基本原理、技术特点及其在多个领域的应用前景，揭示其在推动生物技术进步中的核心价值。
SpyTag-SpyCatcher系统概述
SpyTag-SpyCatcher系统是由Howarth实验室基于S. pyogenes（化脓性链球菌）来源的FbaB的CnaB2结构域的内在异肽键开发的。在这个结构域中，赖氨酸K31的伯胺与天冬氨酸D117的侧链羧基之间在该区域自发形成内部异肽键。CnaB2结构域可以分裂成两个部分：SpyCatcher是一种113个残基的蛋白质，包含反应性Lys31。第二部分称为SpyTag，是一种13个残基的肽，包含反应性Asp117。这两个部分仍然能够以高亲和力（0.2μM）相互识别，并且可以在SpyCatcher和SpyTag之间形成异肽键，形成一个共价结合复合物。
异肽键：是一种类似于肽键的酰胺键，但它是由胺基与位于氨基酸侧链上的羧基或初级酰胺基缩合而成，而不是由主链的氨基或羧基缩合而成。
（数据来源 Hatlem D, et al. Int J Mol Sci. 2019）
SpyTag-SpyCatcher系统的特点：它是一种不可逆偶联技术，高特异性，可达99%的转化率；SpyTag其大小与许多表位标签相当，可以遗传融合到许多蛋白质的N端或C端；SpyCatcher也可以与报告蛋白（如GFP）、表位或纯化标签融合。
SnoopTag-SnoopCatcher系统
基于肺炎链球菌毛粘附素RrgA，已经开发出类似的系统。该蛋白的D4结构域通过一个赖氨酸（K742）和一个天冬酰胺（N854）之间形成的异肽键稳定，该反应由空间相邻的E803催化。这个结构域被分割成一个称为SnoopCatcher的支架蛋白和一个称为SnoopTag的12个残基肽段，它们在混合后可以自发形成共价异肽键。
（数据来源 Hatlem D, et al. Int J Mol Sci. 2019）
该系统与SpyTag-SpyCatcher正交；SnoopCatcher不会对SpyTag作出反应，SpyCatcher也不会对SnoopTag作出反应。这允许同时使用两个系统来生产“多蛋白”，即可编程的模块化多蛋白，用于生物技术应用。
（数据来源 Keeble AH, et al. Chem Sci. 2020）
SpyLigase/SnoopLigase系统
Howarth课题组随后又发明了SpyLigase系统，就是上面的思路，将CnaB2结构域一分为三，N端和C端的Beta-sheet截出来，其余的部分当作一个酶来用，分别称为SpyTag，K-Tag，SpyLigase。
后来该课题组又使用了同样的思路发明了SnoopLigase系统，并催化修饰SnoopTag的赖氨酸（SnoopTagJr）与第二个肽DogTag中的天冬酰胺之间的异肽形成。该系统的效率超过95%，对温度和反应条件的敏感性低于SpyLigase。此外，由于SnoopTagJr和DogTag对Snopligase具有相对较高的亲和力，固定Snopligase可以洗去未共轭的反应物，然后洗脱本质上纯的融合产物。
（数据来源 Hatlem D, et al. Int J Mol Sci. 2019）
Spy&Go：非反应性SpyCatcher的亲和纯化
Spy&Go技术使用一个非反应性突变体的SpyCatcher（SpyDock），它不会与SpyTag形成共价键，从而允许通过亲和层析方法纯化含有反应性SpyTag的蛋白质。Spy&Go可以用于纯化细菌或哺乳动物表达的蛋白质，与Ni-NTA纯化相比，能够获得更高的纯度。SpyDock树脂可多次再生，并可在20%乙醇中保存，Spy&Go最初的主要应用之一是纯化疟疾抗原，然后将其与VLPs偶联作为候选疫苗，而不会产生抗his标签的免疫反应。
（数据来源 Keeble AH, et al. Chem Sci. 2020）
SpyTag-SpyCatcher系统的应用
由于其特异性、不可逆的共价连接以及使用方便，SpyTag/SpyCatcher偶联系统已经在许多不同的应用中得到应用。
蛋白质的锚定和聚集
SpyTag/SpyCatcher系统可以用于将蛋白质精确锚定到各种表面或颗粒上，如金纳米颗粒、量子点、石墨烯以及塑料颗粒等。SpyTag/SpyCatcher系统可以用于控制蛋白质的聚集状态，这对于研究蛋白质的多聚化和功能。例如，通过SpyTag/SpyCatcher系统可以构建具有特定多聚体状态的蛋白质复合物，这对于研究信号传导和酶活性调控等生物学过程至关重要。
（数据来源 Keeble AH, et al. Chem Sci. 2020）
蛋白水凝胶的修饰
SpyTag-SpyCatcher系统可以用于蛋白质水凝胶的修饰。水凝胶已应用于医学领域，例如作为人工细胞外基质材料、组织工程学以及细胞培养。将SpyCatcher融合到用于水凝胶合成的聚合物材料中，可以在水凝胶后用SpyTagged蛋白修饰，以模拟特定的微环境。SpyTag-SpyCatcher系统被用作一种快速、简单的分子工具，可同时将不同的目标分子掺入水凝胶中并呈现在水凝胶上，从而避免了繁琐的工程过程。
（数据来源 Hatlem D, et al. Int J Mol Sci. 2019）
蛋白质功能活性增强
SpyTag-SpyCatcher系统通过创新的环化技术，即形成所谓的SpyRings，显著增强了蛋白质的功能性和稳定性。这种环化是通过将单个蛋白质的N端SpyTag与C端SpyCatcher融合，或者反过来，实现蛋白质的自我环化。这种独特的环状结构赋予了蛋白质更高的内在韧性，使其能够抵抗超热变性和聚集，同时保持或甚至增强其生物学活性。SpyRings可以作为更稳定、更耐用的生物催化剂，提高生产效率和降低成本。
（数据来源 Hatlem D, et al. Int J Mol Sci. 2019）
在细胞生物学的作用
蛋白的定位成像：SpyTag-SpyCatcher系统能够在活细胞中实现对蛋白质的精确标记和追踪，用于研究蛋白质的定位和动态变化。该技术通过将SpyTag融合到细胞表面蛋白并用SpyCatcher结合荧光团，允许对细胞表面蛋白进行成像和分析。
重新靶向细胞杀伤：SpyTag-SpyCatcher可以对CAR-T细胞进行模块化重定向，从而实现可调T细胞活化，例如，在发生危及生命的细胞因子风暴时减少活化或在发生免疫逃逸时将T细胞重定向至新靶点。
模块化免疫突触的形成：通过SpyTag-SpyCatcher系统，可以构建模块化的免疫突触，其中一个细胞表达SpyTag，另一个细胞表达Strep标签，通过可溶性的Strep-Tactin-SpyCatcher复合物调节细胞间的通讯。
免疫激活：细胞外部的Spytag连接膜蛋白或外膜囊泡可与Spycatcher融合抗原反应，诱导强烈的免疫应答，这对于疫苗开发和免疫治疗策略至关重要。
RNA-蛋白质相互作用图谱：利用SpyTag不可逆的相互作用优势来减少背景干扰并提高拉下效率。
核小体重塑：SpyTag融合到转录因子中以编码方式改变核小体定位或用于缩小版的Cas9进行CRISPR介导的基因编辑。
（数据来源 Keeble AH, et al. Chem Sci. 2020）
在疫苗中的应用
SpyTag-SpyCatcher系统还用于将蛋白质模块化组装到纳米颗粒和细菌外膜囊泡（OMV），用于疫苗开发。相同的系统可用于与噬菌体衣壳蛋白融合的酶的体内封装，以产生蛋白质纳米区室，以及用于病毒样颗粒（VLP）的修饰，用于将抗原递送到免疫系统，同时成功保留了组装蛋白质的结构和功能。利用SpyCatcher和SnoopCatcher系统的交替组合，可以在疫苗载体表面顺序耦合多种抗原，构建多价疫苗。
（数据来源 Ahmadivand S, et al. Vaccines (Basel). 2024）
在抗体药物中的作用
SpyTag-SpyCatcher技术提供了一个模块化的抗体平台，允许研究人员快速组合不同的抗体片段，从而创建具有特定功能的抗体结构，以适应不同的研究和治疗需求。利用SpyTag-SpyCatcher技术，可以快速地从SpyTagged Fab抗体片段与SpyCatcher融合蛋白中生成双特异性抗体。这种连接方式不仅提高了生产效率，还增强了抗体的稳定性和疗效。有研究发现在SpyCatcher中引入特定的半胱氨酸突变（如S59C），可以创建可逆抑制的SpyCatcher（SpyLock），通过添加还原剂（如TCEP）来控制SpyCatcher的活性。通过SpyLock技术可以实现对抗体活性的精确调控，这为抗体药物的开发提供了新的策略。
（数据来源 Hentrich C, Putyrski M, Hanuschka H, et al. Nat Commun. 2024）
小结
SpyTag-SpyCatcher系统作为一种创新的蛋白质标记和定位技术，具有高特异性，操作简单，不可逆的供价连接，以及其模块化的组装能力。它不仅能够精确控制蛋白质的锚定和聚集，还能在活细胞中实现对蛋白质的精确标记和追踪，这对于深入理解蛋白质的动态变化和生物学功能至关重要，其在疫苗开发和抗体药物设计中的潜力尤为显著，预示着个性化医疗和精准治疗的新纪元。
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