背景
黏蛋白o -聚糖唾液酸Tn抗原（sTn，Neu5Acα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr）是一种与不同类型癌症相关的抗原，通常与较高的转移风险和不良预后相关。尽管人们努力开发用于诊断和免疫治疗的高特异性抗s-Tn抗体，但在诱导针对糖结构的高亲和力抗体方面遇到的挑战限制了其有效性，导致其滴度低和保护时间短。目前缺乏抗s-Tn抗体特异性的实验结构见解，这阻碍了其对肿瘤细胞识别的优化。
2024年12月16日，Cátia O. Soares团队在JACS Au上发表了一篇名为“Decoding the Molecular Basis of the Specificity of an Anti-sTn Antibody”的研究，该研究使用了一种综合的结构方法，结合x射线晶体学，核磁共振波谱，计算方法，糖/糖肽芯片和生物物理技术，深入研究了新的临床前抗sTn单克隆抗体L2A5识别sTn的分子基础。数据表明，L2A5抗原结合片段（Fab）能特异性地结合sTn核心部分。其中Neu5Ac基团与受体建立关键相互作用，而GalNAc基团提供额外的接触。L2A5对肿瘤相关MUC1和MUC4黏蛋白来源的sTn糖肽具有良好的特异性，这可能有助于其选择性靶向肿瘤细胞。这一新发现为这种抗sTn抗体在诊断和靶向治疗乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌等肿瘤中的合理改进和潜在应用提供了希望。
L2A5 IgG和Fab格式保留对sTn抗原的特异性
利用新糖脂（NGL）微阵列评估了聚糖的结合特异性，发现两种抗体格式（Fab和IgG）保持了与短黏蛋白o -聚糖核心sTn二糖NeuAcα2-6GalNAc连接丝氨酸的主要结合。通过流失细胞术分析发现L2A5 Fab和IgG均能与表达sTn的三阴性乳腺癌细胞（MDA-sTn）保持结合，而它们不能与表达非sTn的亲本细胞（MDA-WT）结合。
通过NMR波谱对L2A5识别唾液酸聚糖的分子洞察
通过（STD）NMR实验进一步分析了L2A5 Fab对sTn抗原的两种呈递物sTn-Thr和sTn-Ser识别的分子细节。对于sTn–Thr和sTn–Ser获得的STD衍生的表位图谱表明，Neu5Ac单元是距离 L2A5 Fab结合位点最近的部分，NHAc基团接收最高的STD响应。说明Neu5Ac部分是L2A5 Fab识别sTn抗原的核心区域，其NHAc基团与L2A5 Fab的结合位点有强烈的相互作用。邻近的GalNAc基团的STD强度较弱，表明该单糖在结合事件中的参与程度较小。
用x射线晶体学测定L2A5和sTn相互作用的分子基础
将L2A5 Fab与sTn–Ser和sTn–Thr抗原共结晶，获得了分辨率为2.3 Å和2.6 Å的晶体结构。在晶体中，sTn–Thr/Ser与L2A5 Fab的结合构象显示，α（2，6）Neu5Ac-GalNAc连接采用的是−g（−60°）和gt（60°）构型，分别围绕φ和ω二面角。
L2A5 Fab识别Neu5Ac部分，GalNAc部分与Fab建立的接触较少，而连接的Ser/Thr氨基酸残基暴露于溶剂，它们参与额外的非共价接触的作用很少。关键的Neu5Ac基团与W91 L残基之间发生了CH–π相互作用，而GalNAc单元与D50L、Q89L和R46L残基之间存在氢键。相应地，H4 Neu5Ac指向W91 L的中心点以及N-乙酰基团。这与在TR-ROESY NMR光谱中观察到的结合状态下的化学位移一致。α2–6-唾液酸几何结构对于L2A5识别事件至关重要，这有利于连续存在的GalNAc/Gal基团的存在。
W91L在L2A5单克隆抗体识别sTn中的关键作用
对L2A5 Fab和sTn-Ser或sTn-Thr的等温滴定热力学（ITC）实验分析显示，复合物的比例为1:1，解离常数（K D 's）分别为1.76和4.47微摩尔。将W91L突变为更小的（W91AL）或带正电荷的氨基酸（W91RL）导致完全丧失与sTn抗原（sTn-Ser和sTn-Thr）的结合，强调了该W残基在相互作用中的关键相关性。
在MUC1和MUC4糖肽类中L2A5与sTn的相互作用
L2A5 Fab仅识别与sTn抗原糖基化的肽，强调了L2A5对sTn抗原的特异性结合，而没有任何对Tn-、T-和sT–抗原的识别。在糖肽阵列呈现中，抗sTn的L2A5 Fab以糖基化位点特异性的方式识别来自MUC1和MUC4的肽序列。L2A5 Fab优先结合MUC1的GST*AP序列上的sTn-Thr抗原和MUC4的TS*SAST上的sTn-Ser。在MUC1糖肽中，sTn−Thr抗原的结合模式显示sTn基团垂直于肽段；在MUC4糖肽中，sTn−Ser抗原的结合模式显示，sTn基团平行于肽段。
糖肽阵列和MD数据表明，与癌症相关的MUC1和MUC4糖蛋白独特的肽骨架和氨基酸组成可能会调节L2A5 Fab与sTn抗原的最佳结合相互作用。微阵列分析所提示的MUC1和MUC4特异性识别很可能有助于选择性靶向肿瘤细胞而非健康细胞。
总结
该文章揭示了单克隆抗体对sTn抗原的识别机制，数据显示抗sTn mAbs在诊断和治疗表达sTn的癌症（如乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌）方面具有潜力。本文报告的结构方法是稳健的，可以扩展到加速不同的抗糖抗体的人源化过程，并提高其特异性和亲和力，为抗体领域的研究做出了巨大的贡献。
