背景
大肠杆菌是微生物学中研究最多的微生物之一。由于其生长迅速、易于基因操作和相对较高的蛋白质产量，它在重组蛋白生产中得到了非常广泛的应用。尽管有这些优点，但它不能有效地自然分泌蛋白质仍然是一个缺点，导致蛋白质以包涵体的形式聚集在细胞质中，从而导致总蛋白质产量低。已经设计许多方法来减轻这一弱点，加强细胞外分泌，以增加蛋白质产量。
2025年3月3日研究人员在World J Microbiol Biotechnol上发表了一篇名为“Advancements in Escherichia coli secretion systems for enhanced recombinant protein production”的文章，该文章综述了大肠杆菌的天然和工程分泌系统，强调了它们在增强非糖基化蛋白分泌方面的潜力。自然一步（例如I型和III型分泌系统）和两步系统（例如Sec和Tat途径）与基因工程、诱变和合成生物学方法的最新进展一起详细介绍，旨在提高蛋白质产量、折叠和分泌效率。新兴技术，如ESETEC®和BacSec®平台，为更高的蛋白质产量提供了可扩展和经济高效的解决方案。主要挑战包括有限的细胞能力和蛋白质聚集，通过创新的策略，如细胞壁修饰，伴侣共表达和培养基优化来解决。本文综述了大肠杆菌对工业应用的适应性，以及重组蛋白技术的前景。
大肠杆菌膜结构
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞膜由三层结构构成，内膜（IM），外膜（OM），周质空间。周质空间：提供一个高度氧化的环境，有助于蛋白质折叠，二硫键形成以及伴侣蛋白辅助稳定，这些对于有效的分泌至关重要。周质中的积累有时会导致蛋白质聚集，则需要进一步优化分泌途径。
外膜：外膜蛋白（OMPs）通常具有β桶状结构，主要参与酶促反应和物质转运。外膜的双层膜由内侧的磷脂和外测的脂多糖（LPS）构成，其中脂多糖可通过其成分内毒素在细菌裂解时释放，在宿主内引发免疫反应，有助于细菌防御。
细胞包膜：作为附属物（如鞭毛和毛）的附着点，帮助细菌细胞运动、交流和附着。包膜蛋白参与了一步分泌和二步分泌途径。
大肠杆菌的天然分泌系统
一步分泌系统
通常大肠杆菌使用T1SS（I型分泌系统），并与鞭毛T3SS（III型分泌系统）一起在其自然状态下进行蛋白质易位。
I型分泌系统（TISS）：由内膜ATP结合蛋白（ABC），外膜孔蛋白（OMP）和膜融合蛋白（MFP）组成，他们在细胞质和细胞外之间形成一个通道，使蛋白质能够完全绕过周质。利用一步分泌系统生产重组蛋白有几个缺点。选择的目标蛋白需要一个分泌载体（例如：蛋白+HlyA）；分泌系统依赖于HlyB/HlyD的共同表达来分泌。
III型分泌系统（T3SS）:一种高度特化的分泌途径，它能实现蛋白质的胞内递送。
二步分泌系统
二步分泌系统通过内膜再通过外膜将蛋白质分泌出去，通用分泌（Sec）途径和双精氨酸转位酶（Tat）途径分别用于将未折叠和折叠状态的蛋白质从内膜转运到质周间隙。通过2型分泌系统（T2SS）和5型分泌系统（T5SS）从外膜转移到外部环境。采用两步分泌途径可以增强多种蛋白质的分泌，对外膜进行改造可以促进周质内蛋白质向细胞外释放。
蛋白质通过内膜的转运
Sec途径：通常转运未折叠蛋白，在Sec通路中，靶蛋白与SecA/SecB偶联或信号识别蛋白（SRP）偶联。在信号肽的帮助下，许多蛋白质进入存在于IM上的Sec转位酶，并将蛋白质转运到外周质中。Sec转运酶通常包括SecYEG和SecA蛋白，用于蛋白质的翻译后分泌。SecA的ATP水解提供能量，SecYEG形成跨膜通道，SecB（一种在转位前稳定前体蛋白的分子伴侣）稳定未折叠蛋白。
Tat途径：转运折叠蛋白，带有辅助因子的蛋白通过另一种称为双精氨酸转位酶途径或Tat途径的途径在IM中易位。Tat通路利用TatBC和TatBC识别的Tat（A）复合物一个特定的信号并与之绑定。这导致招募各种TatA单体，形成跨膜通道的蛋白质易位。Tat的转运效率低于Sec的转运效率。
提高分泌效率的优化策略
信号肽序列的优化
优化信号肽可提高转运效率，稳定性，特异性来增强重组蛋白的分泌。常用策略包括如下：
1）合理设计和诱变，以修改疏水性和切割位点，以便更好地分泌；
2）与MBP或OsmY等载体蛋白融合，以稳定新生多肽并防止降解；
3）通过定向进化筛选，通过遗传文库识别高效信号肽；
4）可以使用SignalP和TatP等计算工具设计合成信号肽；
5）菌株工程方法，如共表达伴侣蛋白或修饰膜透性，进一步提高分泌效率。
菌株的基因工程改造
通过CRISPR-Cas9技术对细菌细胞壁进行改造提高膜通透性来增强分泌，例如基因的精准敲除或敲入，从而调控与分泌的相关基因表达，例如编码伴侣蛋白，信号肽或外膜转运蛋白的基因。还可以通过降低蛋白酶活性，减少蛋白降解以及改善细胞应激来优化菌株，提高整体分泌效率。
培养基优化和化学方法
调整培养基的成分，例如添加葡萄糖和甘油作为碳源提供能量；培养基的pH和渗透压也起着重要作用。添加化学添加剂IPTG进行蛋白诱导；添加表面活性剂吐温-20可以减少疏水性蛋白质的聚集。添加二甲基亚砜（DMSO），甘油或甜菜碱可以稳定折叠中间体，减少错误折叠或聚集。添加半胱氨酸，谷胱甘肽或二硫苏糖醇（DTT）可以促进二硫键的形成。
新兴技术平台
ESETEC ®系统是由Wacker公司开发的一种大肠杆菌蛋白质分泌系统，基于大肠杆菌K12菌株。
基因敲除外膜空间的minA和minB基因，优化外膜和信号肽，使其在表达后能够分泌重组蛋白。该系统可以生产原核，真核，哺乳动物来源的非糖基化蛋白质，大小范围在5kD到150kD之间。
BacSec ®是由Oncosimis Biotech开发的一款新技术，整合上游和下游过程，采用连续生物处理模式，通过灌流技术提高蛋白产量，降低生产成本。该平台无需破坏外膜即可实现蛋白分泌，减少宿主细胞蛋白污染。
总结与展望
随着基因工程、合成生物学和过程优化技术的发展，有望进一步提高大肠杆菌的蛋白分泌效率。例如，开发工程化伴侣系统、设计杂合信号肽以及采用连续生产技术等，将推动重组蛋白生产技术的进步。大肠杆菌在重组蛋白生产中具有广泛应用前景。通过优化分泌系统和生产流程，可实现更高效、更经济的蛋白生产，满足工业和医疗领域的需求。
