在抗体开发过程中，选择与抗原正确表位结合的正确抗体对于获得最佳治疗效果和发挥所具备的作用机制至关重要：
为了中和或阻断特性，抗体通常选择结合位于或靠近受体和配体之间的界面的表位；
对于激动剂抗体，可以选择与先前经过充分验证的激动性抗小鼠抗体同源的表位；
对于抗体效应子功能，不同抗原识别表位可以差异性地募集补体以发挥补体依赖性细胞毒性 (CDC) 功能，影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 诱导的水平；
此外，结合不同抗原表位的抗体可能会不同地影响受体异二聚化、内化、配体结合，并最终影响受体功能等。
（数据来源He W, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016）
最近mAbs刊登了题为“Epitope mapping of monoclonal antibodies: a comprehensive comparison of different technologies”的研究论文，系统的总结了当前七种广泛使用的抗体表位鉴定方法（X射线晶体、肽阵列、丙氨酸扫描、结构域交换、氢-氘交换、化学交联和羟基自由基印记法），阐述了每种技术的优点和缺点。
（文章发表信息）
X射线（X-Ray）：
该方法利用蛋白质晶体衍射的X射线模式来解析蛋白质的原子级结构，从而揭示抗体与抗原相互作用的详细信息。X射线被认为是在原子分辨率下高精度识别抗体与抗原的单个氨基酸之间的关键相互作用的金标准，目前最先进的应用可以将与抗体结合的抗原分辨率高达 1.2 Å，但是获得抗体-抗原复合物的晶体结构需要时间长，成功率低，耗费较大。
（数据来源Bianchi M, et al. Immunity. 2018）
肽阵列（PepArr）：
该方法利用多肽库，通过对具有不同长度和序列的多肽进行筛选，找到与抗体结合的特定多肽片段，从而揭示抗体与抗原相互作用的关键区域。多肽微阵列抗体表位筛选的优势在于可以在较短的时间内高通量地分析抗体和蛋白质抗原之间的相互作用，但多肽在抗体结合中可能无法完全模拟整个蛋白质的结构和功能。
（数据来源Farrera-Soler L, et al. PLoS One. 2020）
丙氨酸扫描（ALN）：
利用了丙氨酸扫描的原理，通过逐个替换抗体结合区域的氨基酸，评估每个替换对抗体-抗原结合的影响。分析实验结果，识别对抗体结合至关重要的氨基酸酸残基，即抗体表位的组成。丙氨酸扫描法可以提供关于抗体结合位点的高分辨率信息，有助于理解抗体与蛋白质抗原相互作用的细节。这种方法通常依赖于对抗体和蛋白质抗原的精确结构信息，但丙氨酸扫描并不能考虑到蛋白质抗原整体结构和动态性。
（数据来源Davidson E, et al. Immunology. 2014）
结构域交换（DomX）：
将抗原中的结构域或片段替换为源自不同物种的同源序列的等效结构元件，通过研究这些结构域交换的抗原和抗体的结合性能，从而推断出抗体与抗原相互作用的关键区域。 结构域交换只能识别不同物种之间天然不同的残基，而这些残基可能不会在观察到的结合丧失中发挥作用。
（数据来源Dang X, et al. MAbs. 2023）
氢-氘交换（HDX）：
氢-氘交换是一种基于质谱的表位作图技术。通过在溶液中将蛋白质暴露给氘代水（D2O），然后通过质谱分析来检测蛋白质的氢-氘交换程度。当抗体与抗原结合时，它会保护结合区域的氢-氘交换，从而揭示结合位点。氢-氘交换抗体表位筛选具有高灵敏度和高分辨率的优势，允许在蛋白质结构水平上了解抗体和抗原的相互作用。但需要先进行专业的质谱分析，并且通常需要有深入的专业知识来解释结果。
（数据来源Ständer S, et al. Anal Chem. 2021）
化学交联（XL）：
这种方法通常需要使用特定的化学交联试剂，这些试剂能够形成可逆或不可逆的共价键，将抗体与抗原结合。通过使用交联剂将抗体与抗原交联在一起，然后通过对交联产物进行质谱分析来鉴定抗体结合位点（表位）的方法。化学交联法可以提供抗体结合位点的直接信息，且不依赖于抗体的晶体结构，但化学交联可能导致一些结构改变，此外，选择适当的交联试剂和条件对于成功执行这种实验至关重要。
（数据来源MtoZ-Biolabs）
羟基自由基印记（HRF）：
与化学交联法类似，该方法基于羟基自由基对蛋白质残基的氧化敏感性：将抗体与蛋白质抗原相互作用，形成抗体-抗原复合物，通过将羟基自由基引入溶液中，使其与抗体-抗原复合物发生反应，标记在抗体结合区域的氨基酸残基，将羟基标记的蛋白质进行质谱分析，以确定羟基标记的位置。
（数据来源McKenzie-Coe A, et al. Chem Rev. 2022）
汇总：
结构域交换、肽阵列和丙氨酸扫描这三种基于功能的方法分别提供链级、肽级和残基级分辨率，在该文献测试的所有技术中，肽阵列的成功率最低。结构域交换法的价值在于其在产生高级映射结果方面的高成功率，该结果可以与其他方法交叉验证并用于指导丙氨酸扫描中的残基选择。氢-氘交换、化学交联和羟基自由基印记法都是基于结构的表位作图方法。这三种技术都显示出很高的成功概率，并且没有抗原大小的限制，所有技术都需要昂贵的高分辨率质谱和专业解读知识。
