骨肉瘤(OS)转移性和复发性的预后不佳，在儿童和年轻人中仍然是一种令人沮丧的恶性肿瘤。由于肿瘤内的异质性和潜在靶向蛋白的不确定性导致大量脱靶表达，骨肉瘤中的免疫疗法不像其他一些特异性靶向癌症类型有前途。
（数据来源ChenC,etal. CancerLett.2021）
2023年6月Nature Communications刊登了题为“ALPL-1is a target for chimeric antigen receptor therapy in osteosarcoma”的研究论文，该研究根据30多年前分离出的2株抗骨肉瘤细胞抗体，筛选确定该抗体识别骨肉瘤细胞上特异性（尤其是肺转移）的靶标ALPL-1，根据抗体序列构建了CAR分子并证明表达这些CAR分子的T细胞能够特异识别骨肉瘤细胞并杀死它们，在临床前动物模型验证中也表明该CAR-T细胞有效控制了不同人类异种移植模型（包括原位和转移环境）中的肿瘤进展，从而确认ALPL-1是骨肉瘤中基于CAR治疗的一个极有吸引力的靶点。
（文章发表信息）
抗骨肉瘤细胞抗体发现：
30多年前，通过使用来自人骨肉瘤细胞对BALB/c小鼠进行免疫接种，制备了针对肉瘤相关细胞膜抗原的单克隆抗体，其中七种产生的抗体与骨肉瘤细胞结合，但不与自体皮肤成纤维细胞结合。来自这7个克隆中的2个（TP-1和TP-3）的单抗同时不与非肉瘤性肿瘤细胞或外周血淋巴细胞发生交叉反应。对冷冻组织切片的免疫组织化学研究表明，TP-1(IgG-2a)和TP-3(IgG-2b)抗体具有特征性和相同的特异性特征。
（数据来源BrulandO,etal. IntJCancer.1986）
确认TP-1和TP-3识别靶标：
研究人员使用Retrogenix平台筛选了近5000种编码膜蛋白的不同cDNA的集合，对于两种TP抗体，在连续两轮中提取了相同的靶标，并在最后一组中得到确认，目标被确定为ALPL基因(NM_000478.6)异构体-1(NP000469.3)，有趣的是，同种型3 (NP 001120973.2) 也包含在筛选中，与同种型1仅相差N端55个氨基酸，TP抗体无法识别。。
（Retrogenix平台筛选候选靶标蛋白）
进一步通过过表达和敲除实验证实了抗体针对ALPL-1的特异性（下图a,b,c），另外研究了ALPL-1的存在与骨肉瘤肺转移样本相比，在相关健康组织（骨、肺）中，检测到病变组织的显着增加（下图 e,f,g）。
（TP-1和TP-3抗体表征）
构建靶向骨肉瘤CAR-T：
使用先前公布的杂交瘤序列来设计scFv，并将它们亚克隆到第二代CAR骨架中（下图a），TP-1和TP-3衍生CAR分别命名为OSCAR-1和OSCAR-3：首先验证OSCARs保存了针对ALPL-1的TP抗体特异性（仅在存在ALPL-1的情况下才检测到杀伤活性，下图c）；使用ALPL基因敲除的骨肉瘤OHS细胞（下图b）观察到目标的去除对OSCAR定向杀伤具有保护作用（下图c)；当额外的骨肉瘤细胞系用TP抗体染色呈阳性时，这一点得到了进一步证实显示对OSCAR-T细胞敏感（下图d）。这些数据证实了OSCAR对在其表面表达ALPL-1的细胞的特异性。
（靶向骨肉瘤CAR-T表征）
OSCAR-T效力评估：
分析了OSCAR是否可以对表达的T细胞产生足够强的刺激以触发细胞因子释放。在与骨肉瘤细胞系孵育过夜后，OSCAR-3在触发某些细胞因子的释放方面似乎更有效（下图e），OSCAR-T细胞在第21天之前一直保持着强大的短期效应功能，介导了骨肉瘤细胞的有效消除（下图f）。
（OSCAR-T细胞试验）
在人异种移植模型中，OSCAR-1和OSCAR-3均有效控制模型中肿瘤生长。
（OSCAR-T动物模型试验）
OSCAR-T安全性评估：
研究人员检查了OSCART细胞对选定原代组织或健康组织细胞系：骨细胞的间充质干细胞（MSC）、人肾上皮细胞(HREpC)、人肝细胞(HH)、人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)、人肺内皮细胞(Hulec-5a)和人胎儿肺成纤维细胞(MRC-5)在共培养试验中的反应性：与OSCAR-1较低的体外活性一致，这些细胞对成骨细胞有轻微的反应性，只有分化18天的MSC能够将OSCAR-3 T细胞刺激到与对照骨肉瘤细胞相似的程度（下图a）；而其他组织细胞都不能诱导刺激OSCART（下图b）。
（OSCAR-T细胞试验）
小结：
ALPL-1从未被指定为基于抗体的治疗靶标，可能是因为它存在于不同的健康组织中，并且其细胞定位在质膜和胞质溶胶中的报道仍然存在争议。在该研究中，证实了ALPL-1作为骨肉瘤特异性靶标（仅存在于骨肉瘤样本中，在健康组织中几乎检测不到，成骨细胞微量表达），并开发了一项基于该靶标的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法，初步显示出有效的治疗前景，后续将进一步探讨 ALPL-1在骨肉瘤和成骨细胞活动中的作用，以及推进首次人体临床试验。
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