（GPCR家族蛋白，数据来源DahlL,etal. SciAdv.2023）
G蛋白偶联受体(GPCR)超家族是人类膜蛋白和药物靶标中最大的一类，包含约750种膜蛋白，其功能主要取决于它们改变形状、在不同构象之间转换的能力，它们介导细胞生理学和细胞间通讯等许多方面的信号通路，而GPCR功能或信号传导的中断则导致许多疾病状态的病理生理学。
（数据来源LatorracaNR,etal. ChemRev.2017）
所以GPCR也是约30%的已批准治疗药物的针对靶标，尽管GPCR是药物开发中最有针对性的蛋白质家族之一，但这些膜蛋白的动态性也给特异性抗体开发带来了困扰和限制。
2023年5月Advanced Science在线发表了题为“Multiplexed selectivity screening of anti-GPCR antibodies”的研究论文，该研究通过开发了一种多重免疫测定方法，针对215种GPCRs的定制文库测试了407个抗GPCR抗体，基于数据结果提供了有关GPCR家族蛋白的免疫原性以及抗GPCR抗体作为工具试剂和治疗剂的设计和应用见解。
（文章发表信息）
建立抗GPCR抗体多重检测方法：
研究者将GPCR的平行表达与多重蛋白质捕获分析相结合，使用工程标签检测免疫捕获的蛋白，确定溶液中GPCR的相对数量，然后将数据整合到基于网络的界面中，浏览每个抗体和GPCR蛋白的选择性。其中407个抗GPCR抗体大部分来自人类蛋白质图谱(HPA)计划中开发的，而 GPCR文库是通过293F细胞中异位表达了215个双表位标记的GPCR，每个GPCR蛋白包括一个N端Flag标签和一个C端1D4标签，使用含有十二烷基麦芽糖苷（DM）作为洗涤剂，生成洗涤剂胶束包含异质混合物（Micelles）。通过多重蛋白质捕获测定，研究人员以确定哪些抗体在仅识别预期的GPCR目标方面具有选择性。
（实验工作流程和数据分析）
选择性GPCR抗体的发现：
在 407个抗体对205个GPCR的选择性结合筛选中（尽管文库中有215个GPCR，但针对10个GPCR选择的抗体未通过检测的QC。这10个GPCR仅用作脱靶候选物），有61%（407个中的248个）测试的抗体识别了他们预期的GPCR，剩余的159个抗体中，9%（159个中的15个）的抗体富集了预期的目标和至少一个脱靶，另外20%（159个中的31个）剩余的抗体只结合了一个非预期的目标，而71%（159个中的113个）没有富集超过截止值的任何目标。248个高选择性抗体对应于154个独特的GPCR目标。
（抗体选择性阈值和汇总统计）
不同GPCR表位的分析：
在抗体靶向的205个GPCR中，116个(57%被两个或更多配对的抗体靶向，使研究者能够将结合特征与GPCR进行比较，并呈现选择性和非选择性识别GPCR的不同表位。
对于视紫红质家族，α亚家族成员肾上腺素能受体α2B(ADRA2B)被六种抗体中的六种选择性识别，它们针对三个不同的表位区域产生，均位于ADRA2B的细胞内环3 (ICL3)内；β亚家族成员胃泌素释放肽受体被六种抗体中的五种选择性识别，针对两个不同的表位区域产生的，一个在细胞外结构域内（ECD），一个在细胞外环2内（ECL2）；δ亚家族成员CCR7仅被五种抗体中的HPA060045一种抗体选择性识别，尽管使用了三种不同的抗原：一种抗原在ECD中，一种抗原在ECL2中，一种对应于受体的细胞内C末端尾部（CCR7的表达水平低于δ亚家族的大多数受体，因此被归类为“不确定”，这可能表明只有对CCR7具有足够高的亲和力，可以检测到甚至更低水平的这种GPCR）；γ亚家族成员促卵泡激素受体(FSHR)被三个选择性识别，三个不同的表位区域都在FSHR的大ECD内。
（视紫红质家族蛋白识别表位图谱）
在谷氨酸亚家族中，GPCR C类第5组成员D (GPRC5D)被四种抗体中的三种选择性识别。失败的 HPA047203抗体被标记识别ECL2区域，而选择性抗体靶向其ECD (HPA071909)或细胞内C末端尾部（HPA064241和HPA071739）。HPA071739对相关受体GPRC5A具有交叉反应性，相反，针对同一抗原HPA064241产生的另一种抗体仅对GPRC5D具有高度选择性。
（GPRC5D蛋白识别表位图谱）
对于促肾上腺皮质激素释放激素受体1 (CRHR1)测试的6种抗体中有3种针对CRHR1选择性识别，并与代表ICL1的抗原相关联。
（CRHR1蛋白识别表位图谱）
接下来，研究人员根据来自AlphaFoldDB预测的所有抗原结构，分析导致抗体表现出特异性结合或不表现出特异性结合的表位特性：根据低预测局部距离差异测试(pLDDT)得分定义，发现目标抗体显着富集在预测为无序的蛋白质区域；此外根据平均相对溶剂可及表面积(SASA)的定义，暴露于周围环境的残留物中的中靶表位也得到增强。
（抗原的距离差异 (pLDDT) 及相对溶剂可及表面积 (SASA) 测试）
结语：
在根据多克隆抗体的识别表位作图之后，可以使用获得的表位从多克隆混合物中纯化单特异性抗体，在预期测定中测试单特异性后，最合适的表位可用于生成单克隆抗体。文章也补充提供了所有抗体及识别表位注释信息，为指导GPCR靶标抗体开发提供了设计筛选思路。
该篇文献直观的展现了抗GPCR抗体的局限性：既需要保证识别GPCR在不同形状构象上的稳定特异性，更需要较强的亲和力特性，叠加GPCR蛋白暴露表位稀缺，抗体开发难度偏大，而兔源抗体具有较小的抗原识别表位和兔源特有高亲和力成熟系统，是很好的免疫动物源。
武汉迈思生物研发团队聚焦于真核哺乳细胞重组蛋白表达和单B细胞重组兔单抗开发，提供更简单、更高效的重组兔单抗体开发服务，丰富的阳性B细胞克隆量，完美解决GPCR抗体开发难度屏障。
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