背景

中国仓鼠卵巢（Chinesehamsterovary，CHO）细胞是用于商业化生产治疗性抗体的最广泛应用的哺乳动物宿主细胞。补料分批培养因其操作简单、产品滴度高而被广泛用于生产治疗性抗体。尽管培养基和细胞培养技术的发展取得了进步，但在保证良好产品质量的同时，在补料培养中保持高生产率仍然具有挑战性。

2021年9月2日Biotechnol Adv上发表了一篇名为“Factors affecting the quality of therapeutic proteins in recombinant Chinese hamster ovary cell culture”的文章，该文综述了影响重组CHO（rCHO）细胞培养中治疗性抗体质量属性的因素，如糖基化、电荷变化、聚集和降解等，并将其分为3组：培养环境、化学添加剂和培养上清中宿主细胞抗体的积累。了解rCHO细胞培养中影响治疗性抗体质量的因素将有助于开发大规模、高产的补料批量培养工艺，以生产高质量的治疗性抗体。

重组治疗性抗体的质量属性

与产品相关的关键质量属性（CQAs）可以影响药物治疗作用的物理，化学和生物学特性，这些CQAs通常在重组治疗性的抗体中出现，包括糖基化，电荷变异，聚集和降解。

糖基化

糖基化主要是指将复杂的寡糖（也称为聚糖）连接到抗体上的酶解过程。聚糖是由唾液酸、半乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和海藻糖等单糖组成的高度支链的碳水化合物结构。这一酶促过程发生在内质网（ER）和高尔基体。

糖基化对于单链抗体和EPO的生物学活性，溶解性，血清半衰期和稳定性具有重要作用。糖基化对单链抗体补体依赖的细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）中具有重要作用。

电荷变异

治疗性抗体的电荷变化是指抗体的酸性或碱性物种比主要抗体亚型出现的频率更高的现象。抗体电荷取决于组成抗体的可电离氨基酸的数量和类型，酸性物质通常由天冬酰胺（Asn）残基的脱酰胺、更高水平的唾液酸、非经典的二硫键和糖基化形成。相反，碱性物质是由羧基端赖氨酸的不完全消除形成。由于等电点（pI）值的改变和结构差异，电荷的变化会极大地改变单抗在体内和体外的性质，并可能影响药物的生物活性和安全性。

聚集

培养上清液中高度聚集的抗体会导致下游工艺效率较低和产量较低。此外，未被下游过程去除的聚集抗体通过空间位阻降低生物活性，并通过引发不良免疫反应而使药物安全面临风险。mAb的聚集与免疫球蛋白重链和轻链表达的平衡密切相关，也是mAb制备过程中的一个重要问题。在rCHO细胞中，通过平衡这两种免疫球蛋白链之间的表达来减轻这种聚集。双特异性抗体的聚集趋势要高于单克隆抗体。蛋白的内在特性，培养条件的变化，包括温度、pH和剪切应力，都可能导致抗体聚集水平的增加。

降解

抗体降解是指通过酶或非酶促作用破坏蛋白结构，非酶促的抗体降解主要与pH，温度，存储时间的变化有关，这些参数的变化会破坏蛋白的结构稳定性。mAb的结构比其他抗体更稳定，但在铰链区可以发现非酶降解，导致生物学功能降低（ADCC和CDC）。

细胞培养过程中影响重组治疗抗体质量属性的因素

在细胞培养过程中影响重组治疗抗体质量的主要与培养环境，提高生产率的化学添加剂以及从死细胞释放和/或从活细胞分泌的宿主细胞蛋白。

培养环境

温度：CHO细胞在37℃生长最佳，但是一般在培养生产时会在低于37℃培养，以提高重组蛋白的生产率，降低温度可以提高许多重组CHO（rCHO）细胞系的特定生产率（qp）。但是降低温度并总是有利的，例如在单链抗体的生产中，降低培养温度可以通过增加重链和轻链mRNA以及内质网有限的折叠能力来增加重组人源化CHO细胞中单链抗体的聚集。降低温度对产品的影响取决于抗体的属性和类型，因此需要对培养温度进行优化，以提高蛋白的产量。

酸碱度（pH)：CHO与许多哺乳细胞一样，在中性pH值生长较好；培养的pH值对细胞生长，细胞代谢，以及重组蛋白在rCHO细胞中的产量和质量有显著影响。每个细胞的发生过程都有一个最佳pH值，培养的pH值对产品质量的影响取决于细胞系或目标蛋白的类型。在考虑其他因素（如高尔基体pH和用于控制pH的碱）的同时，需要优化培养pH值以生产质量理想的重组蛋白。

渗透压：培养基渗透压是影响细胞生长和重组蛋白产生的关键环境参数。一般CHO细胞培养的标准渗透压是280–320mOsm/kg。在补料分批培养中，培养基渗透压随着培养时间的增加而增加，这是因为在培养和/或反复饲喂营养浓缩物期间，为了保持最佳pH，添加了碱。高渗透压对糖基化修饰有负面影响，但是对蛋白聚集有积极作用。

高渗透压对抗体糖基化的有害影响可以通过使用渗透保护剂（如甘氨酸甜菜碱或脯氨酸）来调节，他们是小分子，有助于细胞在高渗透压下存活。高渗透压可以降低蛋白的聚集趋势，当通过向培养基中添加NaCl来增加培养基的渗透压时，在400mOsm/kg时COMP-Ang1的聚集显著减少。高渗透压对产品质量的影响还取决于培养时间。

有毒的副产物：在细胞培养中，由于细胞代谢，会产生副产物氨和乳酸，当他们积累到一定浓度时，会抑制细胞的生长和重组蛋白的产生。乳酸的积累不会直接影响产品质量，而是通过添加碱剂来控制pH，间接的影响培养液的渗透压。培养期间氨的积累不会提高培养基的渗透压，氨的积累会导致细胞死亡，导致糖苷酶和蛋白酶的积累，会直接影响产品的质量。

为了避免氨的过度积累，可以在培养过程中添加谷氨酰胺以维持低估水平的谷氨酰胺或者使用其他氮源替代谷氨酰胺。研究发现使用谷氨酸替代谷氨酰胺可以降低培养基中的氨浓度，增加单链抗体的半乳糖基化并提高半乳糖基化酶的活性。同样，用α-酮戊二酸替代谷氨酰胺可成功降低培养过程中的氨浓度并增加Fc融合蛋白的唾液酸化。

其他环境因素：培养过程中CO2的积累会对细胞的生长和蛋白的生产有不利的影响，二氧化碳分压（pCO2）的升高会导致细胞外渗透压的增加，pCO2的升高也可能影响细胞内pH（pHi）。pHi和高尔基体pH的变化会影响细胞质和驻留在高尔基体酶的活性，CO2的积累会间接影响产品的质量。溶解氧（DO）是CHO细胞培养过程中影响细胞生长和重组抗体质量的关键参数，稳定的溶解氧控制是必须的。

化学添加剂

组蛋白去乙酰化酶抑制剂：NaBu是CHO细胞培养中应用最广泛的组蛋白乙酰化酶抑制剂，用于增加外源性蛋白的产量。NaBu也会影响重组蛋白的质量。

抗氧化剂：常用的抗氧化剂有L-抗坏血酸2-磷酸，N-乙酰半胱氨酸（NAC），S-磺基半胱氨酸等。他们可以恢复氧化还原平衡，并提高CHO细胞培养中重组蛋白的产量。

细胞周期阻滞，化学伴侣，内质网应激抑制剂：在CHO细胞中诱导G1期阻滞的DMSO是一种广泛用于改进rCHO细胞培养物中重组蛋白产生的化学添加剂；DMSO还充当化学伴侣蛋白，会影响产品的质量。氯化锂（LiCL）可以诱导G2/M期停滞并调节细胞凋亡，可用于增加CHO细胞中Fc融合蛋白的产生。

化学添加剂如NaBu和DMSO激活内质网应激，从而减少抗体合成并诱导CHO细胞凋亡。BIX与NaBu或DMSO共添加可显著提高mAb的产量并改善半乳糖化。因此，选择适合所需抗体的适当化学添加剂是必要的，因为qp增强化学品对产品质量的影响是细胞系和抗体特异性的。

宿主细胞蛋白质（HCPs）

HCPs由活细胞分泌和死细胞释放，在rCHO细胞培养过程中积累在细胞外。培养过程中，培养上清液中积累的糖苷酶、蛋白酶等HCPs会影响产品质量。HCPs是制造过程产生的杂质，会降低蛋白纯度。会导致药物的免疫原性和不稳定性。不同类型的HCPs的数量取决于宿主细胞类型，培养模式和培养持续时间。由于较高的细胞浓度和较长的培养周期，HCP在补料分批培养中的细胞外积累水平远高于分批培养。

在补料分批培养中，由于死亡细胞释放了大量唾液酸酶，EPO的唾液酸化会下降，同样，在培养条件下，Fc融合蛋白的唾液酸化被唾液酸酶减少，从而促进了这种酶的胞外积累。Fc融合蛋白在培养过程中保持较高的活性可以减少其唾液化的损害。

研究发现影响抗体中HCP的浓度分布与抗体的质量属性变化相关。说明在rCHO细胞分批和补料分批培养获得的HCP数据集有助于确定在培养和纯化步骤中去除的HCP，以确保产品的质量。

总结

重组治疗性抗体的质量属性包括糖基化，电荷变异，聚集和降解。影响CHO细胞培养的质量属性的因素主要是培养环境，化学添加剂以及杂蛋白（HPCs）。影响 产品质量的因素取决于特定的治疗性抗体，每种治疗性抗体都有其独特的结构和质量属性。在培养过程中维持产品质量的关键是减少培养基中杂质的积累，可以通过抗凋亡工程抑制CHO的凋亡细胞死亡，减少死亡细胞释放杂质的量。可以敲除编码杂质的基因，从而消除在培养基中的积累。还可以对CHO细胞进行基因工程改造，以保证补料分批培养中的高产品质量。