适当设计的药代动力学（PK）测定法对抗药物抗体（ADA）对相关暴露的影响敏感，是了解ADA中和潜能的替代策略。然而，关于如何开发此类PK检测法以及如何确认ADA对暴露的功能性影响，目前尚无指南。

2024年5月31日罗氏制药的研究人员在Frontiers in Immunology上发表了一篇名为“Characterization of anti-drug antibody responses to the T-cell engaging bispecific antibody cibisatamab to understand the impact on exposure”的文章。在该研究中，基于T细胞结合双特异性抗体cibisatamab的作用机制（MoA），研究人员开发了一种PK分析方法。使用关键的单克隆抗独特型（anti-ID）抗体阳性对照作为ADA替代，在临床前评估其对暴露的影响。本研究的结果可以为开发适当的PK检测方法提供标准，以了解潜在中和ADA的影响。

基于cibisatamab作用机制的PK分析方法开发

设计检测形式以开发合适的PK检测是检测相关药物暴露的关键先决条件。要考虑的第一个重要方面是药物的作用机制。cibisatamab的作用机制基于cibisatamab同时与肿瘤细胞上的CEA/ CEACAM5和T细胞上的CD3ε链结合，从而导致T细胞活化并随后杀死肿瘤细胞。这种双重结合功能用于开发基于作用机制的PK检测。为了模拟ADA对cibisatamab的影响，研究者生成并使用了单克隆抗-抗独特型（anti-ID）抗体作为阳性对照。这些抗-ID抗体针对cibisatamab的特定功能结合位点，允许评估药物的功能性暴露量。

这些抗ID抗体试剂针对抗CEA的靶标结合相关互补决定区（CDR）和cibisatamab的抗CD3结构域，可量化药物浓度，将其游离结合部分暴露于两个靶标，同时实现<1ng/ml的超灵敏检测。在验证和临床研究I期，标准和质量控制药物浓度的测定间统计结果使测定的准确性和精密度在可接受的标准范围内。

研究发现基于MoA的PK检测可检测关键的靶标结合能力药物暴露，并且对抗ID ADA阳性对照的结合干扰很敏感。

研究人员评估了患者相关ADA反应对cibisatamab暴露的影响。cibisatamab ADA滴度的增加与靶标结合能力的cibisatamab暴露减少（患者B）有关，而ADA阴性患者的药物暴露则随时间保持稳定（患者A）。这些数据证实，使用基于MoA的PK检测可以将患者来源的ADA反应与暴露联系起来。

ADA反应的特征分析

使用ADA结构域检测试验确定特定的ADA反应药物结构域，发现ADA反应主要针对cibisatamab的抗CD3域。并且抗CD3结构域与cibisatamab具有结合特异性。

通过使用ADA免疫复合物试验进行IgM和IgG检测，确定ADA反应的同种型，发现在ADA发作时，IgM触发了较低滴度的初始反应，而在稍后的时间点，反应主要由高滴度的ADA-IgG反应决定，同时药物暴露也消失。ADA发作4周后，IgG检测已达到饱和，IgM检测低于临界点，并且暴露丢失。患者中导致暴露显著丧失的ADA反应是由ADA-IgG引起。

抗ID抗体作为ADA阳性对照的高级表征

通过ELISA法和生物层干涉法分析抗-ID与cibisatamab的结合，发现四种抗ID均显示出与 cibisatamab的抗CD3结构域相似的结合特征。

研究人员纯化了特定的抗CD3结构域构建体，并将其用作CDR特定结构域检测试验的捕获试剂，特定的抗CD3结构域构建体要么在重链的V结构域中具有功能性CDR，在轻链的V结构域中具有种系CDR，反之亦然。相应的对照，例如在抗体互补位中具有两个功能性CDR的构建体，用作阳性对照，或抗体互补位中的种系CDR序列用作阴性对照。

使用ELISA测定，每种抗ID抗体均能结合HC/LC阳性对照，但不能结合阴性对照构建体（HC/LC中的种系）。仅一种抗ID（抗ID4）与HC中具有功能性CDR的抗CD3结构域构建体结合，而其他三种抗ID抗体则没有。使用由LC的功能性CDR构建的抗CD3结构域，另一种抗ID抗体（ADA抗ID2）能够结合，而其他三种则不能。通过使用生物层干涉法进行正交结合读数，这些结果得到了额外的证实。总之，所有四种具有相似结合亲和力的单克隆抗ID抗体都显示出与全功能性CDR的强结合。抗ID抗体针对抗CD3可变域中不同的CDR表位，其中包括重链（HC）和轻链（LC）的功能性CDRs。因此，可能具有与cibisatamab与其CD3ϵ抗原受体靶标结合不同的中和干扰潜力。

患者衍生的ADA的表征

为了了解患者衍生的ADA是否也是抗ID抗体并针对功能性CDR，研究人员使用了相同设计的抗CD3结构域构建体和经过修饰的功能性CDR（HC、LC 或两者）来分析ADA发作后4周采集的相同10个患者样本，发现患者衍生的ADA被证实是抗-ID抗体，并且主要针对cibisatamab抗CD3域的重链（HC）的互补决定区（CDR）。

CD3受体细胞实验分析

研究人员为了分析选定的四种抗ID抗体作为相关ADA阳性对照的中和潜力，使用了CD3ϵ抗原受体特异性报告细胞系，发现所有四种单克隆抗ID抗体均完全消除了CD3ε介导的细胞活化。抗 ID抗体可抑制抗CD3 IgG药物与受体抗原-靶标的结合。所有抗ID抗体都是有效的ADA阳性对照，对药物抗原靶标结合和CD3ε介导的信号传导具有中和作用。

为了证明患者中CD3特异性ADA反应的中和干扰，将CD3ϵ特异性报告细胞系与选定的十名患者中在ADA出现4周后采集的相同ADA阳性样本一起使用。患者来源的ADA干扰了药物与CD3ϵ 受体的结合，并引发了与测试的单克隆抗ID抗体类似的ADA中和潜力。ADA对药物-靶标结合的抑制取决于ADA-药物摩尔比。

临床试验中ADA对cibisatamab暴露量的影响

在使用基于MoA的PK检测的I期研究中，发现cibisatamab ADA滴度的增加与靶标结合能力的cibisatamab暴露量的降低有关。

总结

该研究基于cibisatamab的作用机制，开发了一个PK分析方法，使用单克隆抗-抗独特型（anti-ID）抗体作为阳性对照。该方法能够敏感地检测与药物功能相关的暴露量，并评估ADA的潜在中和作用。基于MoA的PK分析方法对于评估ADA的中和潜力和指导临床开发决策具有重要意义。研究提供了开发适当设计的PK分析方法的依据，这对于理解双特异性抗体中和ADA对暴露量的影响至关重要。基于MoA的PK分析方法对于评估ADA的中和潜力和指导临床开发决策具有重要意义。