背景
正确组装由两条不同的轻链和重链组成的四链类IgG双特异性需要形成三个异源二聚体界面：一个由两个不同的重链（HC）Fc结构域形成，两个由重链和轻链（LC）同源配对形成的Fab异源二聚体。如果没有强大的驱动力存在，随机链间相互作用会导致重链同二聚体的形成以及轻链和重链之间的错误配对。同源重链和轻链的正确配对对于从单个宿主细胞高效制备IgG样双特异性抗体（bsAb）至关重要。
2025年3月24日Adimab在MAbs上发表了一篇名为“Design of orthogonal constant domain interfaces to aid proper heavy/light chain pairing of bispecific antibodies”的文章，提出了一种通过使用两个正交常数域（CH1:Ck）接口消除双链抗体中重链（HC）：轻链（LC）错配的通用解决方案，该接口包含计算设计的氨基酸取代。在CH1:Ck界面，Rosetta设计了新的氢键（H键）网络，然后通过Rosetta能量计算来确定具有增强配对特异性和界面稳定性的设计。最终设计包括两个Fab恒定区域的11个氨基酸替换，并在6个具有多种未修饰的人类抗体可变结构域的IgG样bsAb上进行了测试。这些经过工程改造的双特异性IgG分子在哺乳动物细胞系中也表现出高表达滴度，良好的发育特性，并且通过体外免疫原性测定评估，没有显示出增加的免疫原性潜力。计算设计的恒定域突变集为双特异性抗体的生产提供了一种广泛适用的方法，有可能提高治疗性抗体生产的效率和可靠性。
单接口设计（SID）
单接口设计（SID）四链bsAb是指在一个Fab臂上包含野生CH1:Ck域接口，在另一个Fab臂上包含突变的CH1:Ck域接口。研究者使用Rosetta的HBNet算法设计了3,571种CH1:Cκ突变组合，并通过flex ddG能量计算筛选出172/1469种具有较高配对特异性的设计。
使用HEK293瞬时表达，在20种设计中，18种成功表达并进行了LC-MS分析。结果显示，8种设计的正确配对比例高于野生型（WT）（没有恒定域突变）的79%。其中，设计1039和1443的正确配对比例分别达到88%和86%。
双接口设计（DID）
双接口设计（DID）bsAb是在两个Fab臂上都包含突变的CH1:Ck域接口。两种通常属于最佳评分设计组合的设计（设计1443和1039）作为ustekinumab可变域序列背景下的设计“A”（DID中存在的两个CH1:Ck设计的突变集之一）。这两种设计分别与5种设计（设计“B”）进行筛选，这些设计是在ustekinumab可变域序列的背景下克隆的，并通过Rosetta能量计算进一步筛选。
10种DID设计在HEK-293细胞中表达，结果显示所有设计的正确配对比例均高于野生型（71%）。其中，设计1443/1993突变的正确配对比例达到100%（通过LC-MS验证），并且在CEX分析中主峰比例高达88%。
CHO生产的双特异性抗体的可开发性评估
使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系生产五种bsAb，SEC进一步评估了纯度。具有WT恒定结构域或仅含有1个1443或1993突变集（和CH3 KiH）的Fab臂的单特异性对照，通常返回的SEC纯度为>97%。
HIC保留时间不受引入1443或1993配对突变的影响，观察到双特异性抗体的HIC值对应于其两个组成单特异性值的平均值，无论CH1:C��是否发生突变。
AC-SINS分析显示，突变设计略微增加了自相互作用，但未超过临床进展的阈值（5nm）。这表明突变设计不会显著影响抗体的自相互作用特性。与SEC纯度一样，可变区域与恒定区域突变集的方向性也很重要，双特异性分子显示出不同的AC-SINS值取决于它们的方向。
通过差示扫描荧光法（DSF）评估了Fab片段的稳定性，突变设计对Fab的热稳定性和聚集温度的影响较小。虽然某些组合的Fab Tm和Tagg略有下降，但这些变化并未超过可接受的范围。
引入设计集1443或1993后，通过CHO细胞瞬时表达产生的双特异性样品的总产量从使用WT CH1:Ck恒定区域产生的双特异性样品的212 mg/L降低至使用DID 1443/1993产生的样品的185 mg/L。
免疫原性风险的体外评估
对携带1443/1993恒定结构域突变集的单克隆抗体进行的体外评估未发现证据表明这些突变具有额外的免疫原性风险。
晶体结构和结构分析
使用X射线晶体学解析了包含设计1443和1993突变的Fab结构。晶体结构显示，突变设计引入了新的氢键网络，且突变残基主要位于CH1:Cκ界面的核心区域。设计1443和1993的结构与野生型相比，RMSD分别为0.45 Å和0.43 Å，表明突变未引起显著的结构重排。
总结
该文章提出了一组通过计算设计的恒定结构域突变，这些突变可以在单细胞宿主的多个经过测试的可变结构域环境中强制实现正确的重链/轻链配对，这提示了在下游制造和生产环境中生产正确组装的双特异性抗体的价值。高通量筛选试验未显示下游发育风险普遍增加，体外免疫原性试验也未显示免疫原性风险增加。1443和1993突变集的晶体结构揭示了这些设计引入的几个新的氢键的存在。通过计算设计引入的氢键网络显著增强了蛋白质界面的特异性和稳定性。这种设计方法（包括氢键网络设计和多态重新评分）可以作为通用模板，用于设计其他需要优先配对的蛋白质-蛋白质界面。
