摘要: 该文章描述了Siglec-6在体外CLL B细胞向CLL-骨髓基质细胞（BMSCs）迁移和黏附中的作用，以及体内抑制向骨髓和脾脏迁移的作用。在治疗方面，Siglec-6/CD3双特异性T细胞募集抗体（T-biAb）改善了免疫正常小鼠模型的总生存期，并在患者来源的异种移植模型中消除了CLL细胞。研究结果揭示了Siglec-6在CLL中的迁移作用，可以使用Siglec-6特异性T-biAb对其进行靶向治疗。
背景
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的成人白血病，美国每年有4000例死亡病例，它的特点是恶性B-CLL细胞在外周血中积累，并利用其表面的黏附分子迁移到促生存的微环境，如骨髓（BM）和次级淋巴组织（肿瘤微环境/TME）。在患病的CLL和正常B细胞中，BTK、Bcl-2、CD20和CD19靶点的表达导致正常B细胞不加选择地被清除，导致对治疗有应答的患者的B细胞功能受损。因此，确定肿瘤特异性靶点并揭示其生物学作用是CLL治疗的重要治疗目标。Siglec-6是一种凝集素受体，在胎盘，肥大细胞，记忆B细胞中表达受限，研究发现Siglec-6在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中表达，但是目前对于其病理生理作用机制尚不清楚。
2024年6月18日，俄亥俄州立大学研究人员在Nature communications上发表了一篇名为“Siglec-6 as a therapeutic target for cell migration and adhesion in chronic lymphocytic leukemia”的文章，该文章描述了Siglec-6在体外CLL B细胞向CLL-骨髓基质细胞（BMSCs）迁移和黏附中的作用，以及体内抑制向骨髓和脾脏迁移的作用。在治疗方面，Siglec-6/CD3双特异性T细胞募集抗体（T-biAb）改善了免疫正常小鼠模型的总生存期，并在患者来源的异种移植模型中消除了CLL细胞。研究结果揭示了Siglec-6在CLL中的迁移作用，可以使用Siglec-6特异性T-biAb对其进行靶向治疗。
Siglec-6的表达
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）可通过聚糖识别促进细胞间相互作用并调节先天性和适应性免疫功能。Siglecs的CD33相关亚群（CD33r）主要表达在人体免疫细胞上，如单核细胞、巨噬细胞以及B细胞和NK细胞亚群。Siglec-6是一种CD33r siglec，在胎盘、肥大细胞和组织样记忆B细胞中受限表达，但在naïve B细胞中不表达。与健康供者来源的B细胞相比，它在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的白血病B细胞（B-CLL细胞）上过表达，说明Siglec-6是B-CLL特异性标志物，在正常B细胞上表达有限。
siglec-6的配体sTn及其表达
骨髓是B-CLL细胞在CLL患者体内归巢的主要部位之一，唾液酸Tn（sTn）是一种肿瘤相关的糖类抗原，它是siglec-6的配体，sTn与结肠癌和乳腺癌的不良预后和肿瘤转移相关。sTn对siglec-6的具有很强的结合亲和力。研究人员从CLL患者的骨髓抽吸物和健康供者的髋骨样本中提取CLL-骨髓基质细胞（BMSCs），对经CD73和CD90表达鉴定的BMSCs进行的流式细胞术分析，发现与正常供者相比，CLL患者BMSCs表面sTn的表达显著增加，蛋白免疫共沉淀分析结果也表明sTn在CLL患者BMSCs中过表达。
由于DT-40细胞上没有任何表面siglec分子，研究人员使用DT-40细胞系来测试sTn与siglec-6的结合作用。使用流式细胞术，ELISA和免疫共沉淀检测，发现CLL-BMSCs表面的sTn确实与Siglec-6相互作用。与IgG Fc阴性对照相比，sTn显示与Siglec-6 Fc的结合呈剂量依赖性增加。Siglec-6与sTn的结合依赖于唾液酸，Siglec-6对配体sTn具有特异性。
Siglec-6与鸟嘌呤核苷酸交换因子DOCK8结合
研究人员使用质谱法和免疫共沉淀验证，发现Siglec-6可以与鸟嘌呤核苷酸交换因子DOCK8相互作用。
Siglec-6促进体外CLL细胞的迁移和粘附
体外实验发现，JML-1 Ab阻断了siglec-6+原代B-CLL细胞与sTn+CLL -BMSCs的附着。表明B-CLL细胞与CLL -BMSCs的附着需要siglec-6。Transwell迁移试验表明，与用同种型Ab阻断相比，JML-1抑制了B-CLL细胞向CLL-BMSCs的体外迁移。表明Siglec-6在CLL细胞向肿瘤微环境（TME）的迁移和粘附中起潜在作用。
DOCK8和Siglec-6在CLL细胞迁移中的功能作用
研究人员使用CRISPR-Cas9技术在MEC1-002细胞中建立了DOCK8的稳定敲除，Transwell迁移试验显示，与MEC1-002野生型（WT）细胞相比，MEC1-002 Siglec-6敲除（KO）、MEC1-002 DOCK8 KO和MEC1-002双KO（Siglec-6和DOCK8同时敲低）细胞向CLL-骨髓基质细胞（BMSC） 的迁移显著减少。表明DOCK8在Siglec-6依赖性B-CLL细胞迁移中发挥作用。
研究人员通过免疫共沉淀验证，发现与Siglec-6相互作用的DOCK8在CLL细胞的细胞膜上富集，而当Siglec-6被敲除或其配体sTn被阻断时，DOCK8在细胞膜上的水平下降，表明Siglec-6可能通过将DOCK8招募到细胞膜上来促进细胞迁移。
唾液酸Tn/Siglec-6/DOCK8轴依赖的Cdc42激活导致CLL细胞中肌动蛋白聚合
DOCK8先前已被证明通过激活Cdc42和Arp2/3复合物驱动的肌动蛋白聚合与T细胞和树突状细胞迁移有关。具有siglec-6和DOCK8功能的MEC1-002细胞在sTn刺激下表现出Cdc42活化增强（Cdc42- gtp水平升高），这在siglec-6和DOCK8敲除细胞中没有观察到，表明sTn信号通过siglec-6和DOCK8激活Cdc42。阻断sTn与siglec-6结合的JML -1抗siglec-6抗体抑制sTn介导的Cdc42活化。证实sTn介导的Cdc42激活依赖于sTn和siglec-6的相互作用。活性gtp结合的Cdc42与WASP蛋白结合，导致WASP活化，进而促进肌动蛋白聚集。
通过共聚焦显微镜检测，发现当WT MEC1-002细胞经sTn刺激后，F-肌动蛋白聚合增强约为未刺激细胞的2倍。缺乏Siglec-6或DOCK8的MEC1-002细胞在sTn刺激下表现出F -肌动蛋白聚合受损。表明sTn信号通过Siglec-6-DOCK8轴促进Cdc42活化、WASP蛋白募集和随后的肌动蛋白聚合。
siglec-6先前通过募集磷酸酶SHP-2在人类滋养细胞中被认为是一信号分子。但是研究人员发现siglec-6通过DOCK8传递信号不依赖磷酸酶SHP-2。
JML-1抗体在体内抑制siglec-6阳性MEC1-002细胞和原代B-CLL细胞向脾和骨髓的归巢
恶性B-CLL细胞的特征是归巢至脾脏和骨髓（BM），然后滞留在这些组织内，从而为CLL存活提供有利条件。研究人员将JML-1 Ab或同型对照处理的MEC1-002细胞或原代B-CLL细胞通过尾静脉注射到NSG小鼠中，通过流式细胞术跟踪细胞的迁移，发现与同型对照相比，JML-1 Ab阻断后的MEC1-002细胞数量显著减少，JML-1 Ab阻断后在脾脏和BM中检测到的B-CLL细胞数量也显著减少，表明JML-1 Ab减少了恶性B细胞向脾脏和BM的归巢。
靶向Siglec-6的T-biAb对Siglec-6 + CLL细胞的体外疗效
使用Siglec-6/CD3双特异性T细胞招募抗体（T-biAb）在体外实验中显示出对Siglec-6阳性CLL细胞的选择性杀伤作用。
靶向Siglec-6的T-biAb在体内模型中的疗效
靶向Siglec-6的T-biAb在免疫能力正常的小鼠模型中，Siglec-6 T-biAb治疗显著提高了总体生存率。
使用患者来源的异种移植模型，研究人员发现Siglec-6 T-biAb显著减少循环中的白血病细胞数量，以及在脾脏中的白血病细胞数量，表明Siglec-6 T-biAb在体内具有直接的抗肿瘤效果。
总结
该研究发现siglec-6促进B-CLL细胞的迁移和粘附，这是通过siglec-6与DOCK8在siglec-6配体sTn依赖性肌动蛋白聚合中通过Cdc42激活和WASP蛋白募集的相互作用介导的。Siglec-6靶向的双特异性T细胞招募抗体（T-biAb）在小鼠模型中显著提高了总体生存率，并在患者衍生的异种移植模型中有效消除了CLL细胞。siglec-6靶向T-biAb可以特异性消除siglece -6+CLL细胞，并提供生存益处，从而支持临床评估siglec-6靶向治疗CLL患者的基本原理。
