背景
严格评估抗体的可开发性对于在进入临床研究之前优化候选药物至关重要。最近在预测蛋白质结构、表面特性、稳定性和免疫原性的工具方面取得了进展，这使得新生物制剂的开发变得更加顺畅。然而，由于互补决定区（CDRs）的多样性，特别是CDR3s，准确预测单个氨基酸置换对抗体结构的影响仍然具有挑战性。
2024年12月20日，研究人员在Antibodies（Basel）上发表了一篇名为“Integrating In Silico and In Vitro Tools for Optimized Antibody Development—Design of Therapeutic Anti-oxMIF Antibodies”的文章，该研究结合了计算机模拟工具和体外评估，以针对氧化型巨噬细胞迁移抑制因子（oxMIF）改进抗体，基于第一代抗oxMIF抗体imalumab。通过在可变区域引入突变，候选抗体C0083由于其重链CDR3环的重构而显示出降低的疏水性和自相互作用，尽管这些结构变化，C0083仍保留了对靶标的特异性和对oxMIF的结合亲和力。证明少量精心选择的突变足以显著提高抗体的性能。
抗体分子特性分析
Imalumab的Fab片段在结晶时形成了Fab二聚体，而这些二聚体是通过疏水相互作用稳定的。两个Fab之间的相互作用由H:L98、H:W97、H:Y99、L:Y32、L:F92和L:W93驱动。
聚集和疏水性分析：H：W97和L：W93这两个氨基酸都位于相应的CDR3区域。CDR3被认为是决定抗原特异性的最重要区域，因此在这些区域进行突变时应谨慎行事，因为它们可能会极大地破坏功能性抗体结合。
翻译后修饰分析：色氨酸和蛋氨酸是公认的易氧化的氨基酸，可对单克隆抗体的稳定性造成威胁，最终影响其疗效和安全性。残基H:W97、L:M30和L:W93在溶剂中高度暴露，使其易被氧化，因此被选择为突变的候选位点。
免疫原性风险评估：通过分析VH和VL序列，预测了与MHC II类T细胞结合肽的高亲和力，以减少免疫反应。发现重链没有显示出任何高亲和力MHC类II表位，而在轻链中识别出两个潜在的核心表位：I29MTYLNWYQ37（HLA-DRB1*15:01）和F49VASHSQSG57（HLA-DRB1*01:01and HLA-DRB1*15:01）。
框架优化：通过将Imalumab的VL和VH结构域与AbYsis中的所有人类抗体以及IMGT胚系库中的VH3和Vκ1序列进行比较，识别了在框架区中不常见的氨基酸或具有疏水特性的氨基酸：VH的P41、S49、R83和A84，以及VL的D1、Q3、L11、V15、P80和S83。
优化mAb变体设计
通过对表面疏水性升高和聚集倾向、高亲和力T细胞表位、氧化位点以及框架中几个不常见的氨基酸残基的分析，设计选定突变体的重组突变抗体，并使用计算机建模进行筛选。
计算机建模优化抗体变体
利用AbodyBuilder的结构预测模型对优化的mAb变体进行建模，发现引入突变的有益作用是明显的，与Imalumab相比，重链（HC）中的L5Q、P41S和W97Y以及轻链（LC）中的V15T、F49Y和W93F的疏水性指数降低。疏水性最强的氨基酸H:W97和L:W93对Imalumab的表面疏水性有重要影响，因此引入突变H:W97Y和L: W93F有望降低Imalumab的整体疏水性。
优化抗体的表征
优化的mAb变体均保留了对oxMIF的特异性，引入的突变没有破坏抗体的抗原结合位点，抗体仍然能够识别并结合目标抗原oxMIF。携带L:Y36F突变的变体（如C0072、C0074等）表现出对oxMIF的结合亲和力显著降低，并且热稳定性较低，说明L:Y36F对轻链正确的组装至关重要。
选定的突变大大降低了mAb表面的疏水性和聚集倾向。特别是CDR3区域的突变L:W93F和H:W97Y对于减少自相互作用和聚集倾向至关重要。发现L：M30对氧化的敏感性很低。通过引入L:A51G突变，成功去除了预测的高亲和力T细胞表位2，降低了抗体的免疫原性风险。
根据mAb特异性和对oxMIF、SEC、HIC、AC-SINS分析的亲和力以及计算机免疫原性汇总数据，C0083被确定为最有前途的mAb变体。它保留了Imalumab的结合特性，同时由于去除了预测的T细胞表位，表现出显着较低的疏水性和聚集潜力，并降低了免疫原性的风险。
药代动力学和结构分析
C0083的肿瘤半衰期相比Imalumab延长，这种工程化改造显著改善了C0083的PK和BD谱，C0083通过其可变区域的靶向突变与降低的疏水性和聚集倾向直接相关。
对C0083 Fab进行了结晶研究，结果揭示了 H：CDR3环的显着重组。这种重组降低了疏水性和聚集倾向。尽管发生了这些结构变化，C0083仍保持了其对oxMIF的特异性和高亲和力。
但是仅依赖模型而不进行生物物理化学实验验证可能会导致错误的结论，可能错过C0083这样的有前景的候选抗体。
结论
通过计算机模拟分析和实验验证，确定了第一代抗oxMIF抗体Imalumab的表面疏水性和聚集倾向是其半衰期异常短的潜在原因。在Imalumab可变区引入点突变H:L5Q/W97Y和L:F49Y/A51G/W93F，使候选抗体的生物物理化学性质得到显著改善，同时保持了对oxMIF的高亲和力和特异性。含有这些突变的C0083因其显著降低的表面疏水性和聚集潜能而被确定为主要候选突变。此外，它表现出最低的免疫原性风险和改善的药代动力学特征。对C0083 Fab结构分析表明，重链CDR3环的重组是观察到的生物物理化学特性增强的关键因素。这项工作证明了如何通过生物工程解决分子缺陷，从而优化抗体，使C0083及其衍生物成为有望用于癌症和炎症性疾病靶向治疗的候选药物，并将其推向临床验证。
