背景

白细胞介素2（IL-2）是一种激动剂，在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，高剂量重组IL-2（Proleukin®/aldesleukin）是首个获批的基于细胞因子的转移性黑色素瘤（MM）和肾细胞癌 （RCC）免疫疗法。由于IL-2的半衰期较短，大剂量IL-2的给药方案繁琐，以及严重的剂量限制性毒性，包括毛细血管渗漏综合征、心肺、肝脏和肾脏毒性，阻碍了其在癌症免疫治疗中的广泛应用。此外，高剂量IL-2不仅可以扩增抗肿瘤效应细胞，而且还是免疫抑制调节性T细胞（Tregs）的强效生长因子，这通常与癌症患者的不良预后有关。

2024年7月23日，研究人员在MAbs上发表了一篇名为“Discovery and development of ANV419, an IL-2/anti-IL-2 antibody fusion protein with potent CD8+ T and natural killer cell-stimulating capacity for cancer immunotherapy”的研究，该研究中研究人员设计了一种IL-2激动剂，ANV419，这是一种IL-2/抗IL2抗体融合蛋白，旨在通过空间阻碍IL-2与IL-2Rα结合来选择性激活IL-2受体βγ（IL-2 Rβγ）。该激动剂对IL-2 Rβγ具有选择性，半衰期延长，毒性适中，并且能够有效抑制同源小鼠模型中的肿瘤生长。

IL-2抗体/IL-2融合蛋白开发

开发了一种抗IL-2人源化抗体NARA1，将IL-2的N端和C端分别连接在螺旋αA之前和αD之后，从而产生了一个环状排列的IL-2（IL-2CP）。将环状排列的IL-2分子与高亲和力的人源化抗IL-2抗体的轻链可变区（LCDR1）融合，形成抗体-细胞因子融合蛋白。IL-2CP的新N和C末端分别通过甘氨酸-丝氨酸接头与抗体的LCDR1残基Y27d和D30连接。

使用A，B，C三种抗体和一组特定的甘氨酸-丝氨酸接头生成候选融合蛋白，发现抗体A与IL-2结合具有高亲和力，高亲和力IL-2结合抗体A融合蛋白在空间上阻断了环状IL-2与IL-2 Rα的结合。即使使用长接头也是如此。研究发现高亲和力抗体融合在广泛的接头长度范围内保持选择性，而无亲和力抗体融合即使使用非常短的接头也是非选择性的。IL-2与抗体A的融合蛋白带有GGG和GGGG接头，融合蛋白名为ANV419。

通过解析ANV419的结构，发现抗体A和IL-2的结合位点与与IL-2 Rα覆盖的螺旋αB上的大部分IL-2残基重叠。

ANV419对IL-2 Rβγ表达细胞的选择性

在体外刺激的小鼠脾细胞中，ANV419在Tregs的pSTAT5磷酸化中的效力降低，但对CD8+T细胞和NK细胞的活化作用与常规IL-2相当。在体内实验中，单次静脉给药ANV419可以剂量依赖性地诱导CD8+T细胞和NK细胞的增殖，而对Treg细胞几乎没有影响。相比之下，对抗体C融合蛋白则表现出了对Treg细胞的强烈增殖作用。

ANV419可抑制肿瘤生长

H22肝癌肿瘤对ANV419单药治疗反应强烈，ANV419与PD-1或CTLA-4 CPI联合使用时观察到附加肿瘤生长抑制（TGI）。在部分CPI反应性Renca肾细胞癌模型中，使用ANV419单药治疗也实现了显著的TGI，在免疫原性较差的B16F10黑色素瘤模型中仅观察到有限的生长迟缓。Renca中ANV419治疗可显著增强CD8+T细胞和NK细胞对肿瘤的浸润，并且Treg的数量和增殖并没有因ANV419而增加。

使用ANV419也造成NKT细胞（一种表达IL-2Rβγ的细胞类型）增加，但在CD4+T细胞中没有观察到，因为CD4+T细胞在稳定状态下表达的IL-2R水平较低，对IL-2的反应性较低，以及完全缺乏IL-2R表达的B细胞和巨噬细胞。

ANV419其IL-2R信号传导效力和动力学

用ANV419和IL-2刺激后，CD8+T细胞和NK细胞显示出相似的EC50值，但是在Treg中，与IL-2相比，用ANV419治疗后观察到IL-2R介导的信号传导效力降低，说明ANV419对CD8+T细胞和NK细胞的选择性优于对人类细胞中的Tregs。用ANV419刺激的CD8+ T细胞和NK细胞表现出与IL-2相当的pSTAT5动力学，而IL-15的STAT5磷酸化往往比ANV419或IL-2稍快。因此，在CD8+T细胞和NK细胞中，ANV419的IL-2R信号传导效力和动力学与IL-2相当。

ANV419增强NK细胞杀伤能力和ADCC

研究发现用ANV419处理NK细胞不会改变NK细胞受体表面表达水平，但会导致NK细胞的活化状态更高。ANV419处理的NK细胞对NCI-H929骨髓瘤和HCC1954上皮乳腺癌靶细胞的杀伤作用升高。将ANV419和daratumumab或者trastuzumab单抗联合孵育的NK细胞增强了抗体的活性。将它和具有ADCC效应的trastuzumab单抗联合使用，发现其在抑制肿瘤生长方面显示出叠加效应。这些结果表明ANV419增强NK细胞杀伤能力和ADCC。

ANV419半衰期和药理学分析

通过对食蟹猴进行ANV419药理学和毒理学研究，发现ANV419具有延长的半衰期，并促进食蟹猴中CD8+T细胞和NK细胞的增殖。

ANV419会诱导瞬时剂量依赖性炎症反应，但是由于其在高剂量的反馈机制从而不会引发大剂量IL-2的显著不良反应。

总结与展望

该研究通过蛋白质工程的方法克服重组IL-2的缺点，基于IL-2与高亲和力的抗IL-2抗体A的融合，通过环状排列策略，保留抗原/抗体的相互作用，仍然允许IL-2 Rβγ的结合和激活，形成融合蛋白ANV419。该激动剂对IL-2 Rβγ具有选择性，单独治疗或与CPI 联合使用可抑制肿瘤生长，增强CD8+T细胞和NK细胞的浸润和扩增。ANV419半衰期延长，毒性适中，并且能够有效抑制同源小鼠模型中的肿瘤生长。该研究为ANV419在实体瘤和血液系统恶性肿瘤中的临床开发提供了理论基础，既可以作为单一疗法，也可以与检查点抑制剂或ADCC诱导疗法联合使用。ANV419目前处于1/2期临床开发阶段，可能为癌症患者提供比白介素更广泛的治疗窗口。