背景

穿孔蛋白的重组表达、分离及表征是用于理解其生物膜渗透特性的最常见策略之一，研究他们的技术之一就是将他们重组到极化的脂质双分子层中。常规的染色方法（如考马斯亮蓝染色）不够敏感，无法检测到样本中存在的所有蛋白，获得足够活性以进行重构实验，同时纯度足够以显示一致和可重复结果的样本显得尤为重要性。

2024年10月研究人员在nature protocols上发表了一篇名为“How to isolate channel-forming membrane proteins using the E. coli expression system”的文章，该文章描述了如何用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21Gold（de3）ΔABCF菌株来优化目标蛋白的生产，并详细描述了如何通过不同溶解度分离细菌组分，以及如何使用洗涤剂溶液提取目标蛋白。此外，文章还介绍了如何通过离子交换色谱法提高蛋白纯度，并将纯化的蛋白插入外膜囊泡中以便于共纯化。经过优化该方案可以适应于分离受体、载体、泵或任何其它膜活性蛋白质类。

大肠杆菌BL21Gold（de3）ΔABCF菌株的优势

该菌株通过基因工程敲除了OmpF、OmpC、LamB和OmpA这四个主要的外膜孔蛋白基因，从而减少了内源性膜蛋白的表达。这有助于减少在纯化目标蛋白时的污染，提高目标蛋白的纯度。

通道形成膜蛋白的表达纯化

形成通道的膜蛋白主要有三大类：成孔毒素（PTFs），细胞壁通道蛋白，外膜蛋白（Omps），无论PTFs的跨膜结构域是基于α-螺旋还是β-片层，它们都可溶于无洗涤剂的缓冲液中。当诱导剂的量、表达的长度和温度得到优化，PTFs可以在第一次超速离心后在上清液中收集。细胞壁通道蛋白，如MspA家族的通道，在短时间内以类似的方式溶解；萃取后应立即从PFTs等可溶性组分中纯化，但纯化缓冲液必须含有一些去污剂（例如，0.5%辛基- poe）。外膜蛋白和膜蛋白通常大多数最终会出现在包涵体中，必须从包涵体中提取出来，用合适的洗涤剂，在合适的温度下，让合适的颗粒重新悬浮一段时间。当蛋白在上清液中显示出清晰的条带，可以使用色谱步骤进行纯化。

如果目的蛋白是天然表达于革兰阴性菌外膜的通道形成膜蛋白，那么其活性很可能受到周围脂多糖的影响。将omv融合到一个平面的双层结构中，使得我们可以对重组到其原生环境中的孔蛋白进行表征。当蛋白质需要与omv共纯化时，有几个重要的细节需要考虑：首先该蛋白必须与与大肠杆菌分子机制相容的信号肽一起翻译；其次该蛋白的表达必须诱导24小时，以刺激OMVs的产生；并且该菌株必须缺乏OmpA，其缺失是OMVs过量产生的特征。这将使产品的产量提高。

膜通道蛋白表达纯化问题和优化策略

作者在表达和纯化膜通道蛋白的过程中，遇到了一系列问题，同时也提出相应的优化策略来解决这些问题。

诱导表达的OD600：在对蛋白表达条件进行优化时，建议尝试不同的目标OD600值，其中OD600是一个很好的起始点。在这个起始点，发现在30℃的条件下以标准的诱导剂的量诱导后出现2种情况：

情况一：OD600不断增长（如OmpE36），这种变化说明蛋白的表达对细菌的生长是无害的；

情况二：OD600减少，趋于平稳，然后再次增长（如OprO/P）。这种情况说明蛋白表达对细菌的生长是有害的，这种时候可以调整其OD600诱导起始点，在低OD值下诱导较长时间或者在高OD值下诱导较短时间。并降低诱导量和诱导温度（20℃）。

表达质粒：若蛋白不表达，则质粒和ORF存在问题，可以减少诱导剂，在较低的温度下长时间诱导表达，或对其质粒进行重新测序。可通过密码子优化来提高蛋白的表达。如果蛋白表达对宿主有毒性，例如pLysS表达使T7聚合酶失活的溶菌酶，可以增加诱导剂（IPTG高达2mM），在更高的OD下缩短表达时间。

表达温度：诱导前，培养物可以在冰上冷却15min，对于一些长表达或高表达的蛋白质，降低表达温度（不低于20℃）以获得更好的折叠和更少的融入包涵体有利于外膜是有用的。

蛋白提取优化策略：选择适当的洗涤剂和浓度，以帮助从膜组分中提取目标蛋白。调整洗涤剂的浓度和提取时间，以优化蛋白的溶解性和回收率。调整提取缓冲液的pH值和离子强度，以提高目标蛋白的溶解性和稳定性。

总结

该文章描述的方案为逐步优化大肠杆菌重组体系中通道形成膜蛋白的表达、提取和纯化条件提供了合理的策略。表达时间和温度、诱导剂浓度、去垢剂性质和浓度、孵育时间和纯化pH均是可根据特定蛋白进行优化的参数。选择了合适的诱导温度诱导时间，以及合适的去污剂，未来就能更容易地提取蛋白质。文章中提到的协议不仅适用于原核通道形成膜蛋白，还可以用于叶绿体、线粒体或一般真核生物的孔形成蛋白的生产。通过适当的优化，该协议也可以适应于受体、载体、泵或其他任何膜活性蛋白的分离，从而为广泛的生物医学研究提供了一个强大的工具。