背景
富含亮氨酸重复序列的G蛋白受体5（LGR5）是结直肠癌细胞中致癌Wnt信号通路的靶基因，LGR5在人恶性肿瘤中过度表达，例如CRC，HCC，胃癌和卵巢癌，乳腺癌，胶质母细胞瘤和某些B细胞恶性肿瘤。结直肠癌细胞中的LRG5的表达是增殖、迁移、化疗敏感性、克隆形成和体内移植能力所必需的。LGR5在肿瘤细胞中的高表达对肿瘤细胞的增殖至关重要，这标志着LGR5有望成为肿瘤治疗的靶点。虽然LGR5抗体在免疫疗法中有足够的临床应用空间，但缺乏经过稳健验证的合适抗体，这阻碍了治疗的开发。
2024年8月21日研究人员在EMBO molecular medicine上发表了一篇名为“Novel immunotherapeutics against LGR5 to target multiple cancer types”的研究，该研究报告了高度特异的单克隆α-LGR5抗体，该抗体可用于一系列实验和治疗应用。描述了α-LGR5作为一种治疗性抗体的开发过程，以及其作为ADC靶向LGR5+ CRC和pre-BALL细胞的功能验证，以及通过在BiTE和CAR模式中指导细胞毒性免疫癌细胞杀伤。在人类pre-BALL的小鼠模型中证明了α-LGR5在这三种治疗模式中的稳健临床前疗效，从而支持针对所有表达LGR5的癌症类型继续开发基于α-LGR5的免疫疗法。
抗LGR5抗体的制备和验证
LGR5抗体是由人的LGR5的胞外结构域的N端101个氨基酸免疫小鼠获得，发现获的的4个LGR5阳性克隆仅对人类和食蟹猴LGR5具有免疫反应性，但不对小鼠LGR4和LGR5或密切相关的人类LGR4和LGR6具有免疫反应性。蛋白质印迹分析表明所有四个α-LGR5克隆均与LGR5抗原片段1具有结合特异性，发现LGR5的N端15个氨基酸（Frag1A）含有表位，抗体克隆与Frag1A之间存在高亲和力结合。抗体与LGR5结合不会干扰R-spondin1配体的结合，α-LGR5或任何已报道的抗体与LGR5的结合不会干扰其在增强Wnt通路活性中的功能。α-LGR5抗体可通过蛋白质印迹法、免疫荧光法在固定细胞中、以及流式细胞术在活细胞中特异性识别过表达的hLGR5和cLGR5，无法检测其他LGR家族成员。
健康组织和癌症中LGR5表达水平普查
研究发现LGR5在许多癌症中高表达，LGR5过表达特定于一组离散的癌症类型，例如结肠癌和直肠癌、肝癌，急性淋巴细胞性白血病。CRC、HCC、一些ALL病例和健康组织之间存在相当大的LGR5表达窗口。在大多数健康组织中，LGR5的表达水平非常低或检测不到，这为开发针对LGR5的治疗策略提供了可能性，因为这些治疗策略可能会对健康细胞的影响较小。使用特定且经过充分验证的抗体（如α-LGR5）是一种有价值的诊断工具。
α-LGR5特异性检测人类癌细胞系中的LGR5蛋白
使用α-LGR5抗体检测三种人类pre-B- ALL细胞系中LGR5蛋白的细胞表达，发现LGR5定位于细胞内点状结构，LGR5主要在细胞内点和内化的质膜相关小瞬时池中表达。使用α-LGR5对LoVo结肠癌细胞中的LGR5进行免疫荧光检测，发现表达主要局限于细胞内点，细胞表面几乎检测不到LGR5。表明LGR5在这些细胞中主要进行内源性内化。内源表达的LGR5通过内吞途径从质膜快速内化，并被再循环至质膜并导向溶酶体囊泡，α-LGR5抗体可以被LGR5过表达细胞系快速内化。
基于LGR5的抗体-药物偶联物验证
特定于某些恶性肿瘤的LGR5高表达水平、α-LGR5的快速内化动力学以及LGR5运输到溶酶体，这些都为使用基于α-LGR5的抗体-药物偶联物（ADC）靶向癌症带来了令人期待的前景。研究发现α-LGR5-ADC在体外实验中显示出对LGR5阳性癌细胞的高效杀伤能力，并在人类NALM6 pre-B-ALL小鼠模型中证明了其显著的抗肿瘤效果，可有效减少肿瘤生长。
基于LGR5的BiTE体外体内功效表现
基于α-LGR5，研究人员构建了构建了人源化的α-LGR5scFv片段，通过将α-CD3ε scFv与的α-LGR5 scFv融合，生成了CL-BiTE，它显示出对人类CD4+和CD8+ T细胞的高度特异性和强效激活，并有效诱导体外癌细胞杀伤。在体内，CL-BiTE与PBMCs联合注射到NALM6肿瘤携带的小鼠中，显示出对肿瘤生长的抑制效果。在治疗后，观察到肿瘤负担的显著减少，大约减少了两倍。
基于LGR5的细胞疗法有效靶向NALM6细胞
根据α-LGR5 scFv生成了LGR5-CAR-T细胞疗法。LGR5 scFv -CAR-T细胞在体外表现出特异性和强大的肿瘤细胞破坏能力，并且在体内表现出极佳的疗效。接受LGR5 scFv -CAR-T细胞治疗的动物骨髓中的肿瘤细胞数量显著减少，与对照组相比，pre-B-ALL肿瘤负担减少了四倍。LGR5 scFv - CAR表现出的高特异性和有效性展示了有效靶向多种癌症类型的潜力。
总结
LGR5是一种适应性治疗抗体，可用于靶向ADC、BiTE和CAR-T细胞模式中的癌细胞。虽然我们观察到这三种模式在靶向pre-B-ALL肿瘤方面的体内效力不同，但这些兼容的治疗策略为适应各种LGR5+肿瘤类型的不同药效学要求提供了巨大的空间。研究表明LGR5不仅可以用作研究工具和生物标记，还可以为针对一系列表达LGR5的癌细胞的高效免疫治疗组合提供多功能构建块。
