1、对于重组表达定制服务,初步需要了解哪些信息?
答:初步了解信息如以下几点,
(1)研究物种:具体种类,动物、植物、微生物;
(2)蛋白序列信息:是否有序列信息,根据提供序列进行技术分析;
(3)抗体序列信息:是否有抗体序列,没有序列需要重新查找参考序列,然后拟定方案;
(4)报价:根据项目的具体序列信息分析难度确定最终报价参考。
2、简述贵公司平台优势?
答:目前我们拥有自建的两大核心平台:哺乳细胞蛋白表达平台和B细胞抗体开发平台,技术人员10多年重组蛋白&抗体表达经验,蛋白表达案例2000多个。项目先免费让技术同事进行技术评估和方案拟定,服务周到,响应及时。
3、蛋白&抗体最后交付能有多少量,纯化多少?
答:重组我们一般是按照表达体积核算的,因为每个蛋白的特性不太一样,所以蛋白表达量在固定表达体积下有高有低50ug到几毫克不等,最终我们是交付表达纯化的所有蛋白,纯度一般会有85% 以上。如果需要纯度要求很高,我们可以相应进行二次纯化以提高纯度(相应增加一部分费用)。
4、蛋白表达1mg怎么报价的?
答:重组我们一般是按照表达体积核算的,因为每个蛋白的特性不太一样,所以蛋白表达量在固定表达体积下有高有低,最终我们是交付表达纯化的所有蛋白,如果需要按照产量报价,可以由技术同事来评估蛋白的表达难度,再确定最终报价。
5、蛋白表达流程周期是什么样的?
答:如下图所示,一般从基因合成(1-2周)开始,载体构建一周,表达测试(原核1周,真核1-2周),放大生产(原核1周,真核2-3周)。总周期原核大肠杆菌(3-4周),真核哺乳细胞(4-5周)。
6、蛋白有功能活性保证吗?
答:重组表达蛋白在未进行活性验证前不能保证活性,我们只能保证重组表达出来的蛋白序列是跟分子设计构建表达一致的。根据我们的经验,一般真核哺乳表达出来的蛋白基本具备近似天然蛋白的功能活性。
7、能做蛋白功能活性验证吗?
答:因为每个蛋白的功能活性检测标准不一样,涉及到检测方法学的开发,其中还涉及到蛋白相关配受体开发或者细胞通路中其他蛋白检测,建议老师可以根据自己后期实验需求进行检测验证,或者根据具体检测方法学进行评估报价。
8、蛋白一般保存多久?
答:一般蛋白放在-80度能存储1-3个月,4度的话1到2周。像蛋白本身体外稳定性不好的,存放时间更短。
9、蛋白包涵体沉淀还有活性吗?
答:蛋白常规在变性剂的条件下可溶,但基本已经丢失活性,通常包涵体复性操作会带来蛋白的大量丢失得率降低,同时复性后的蛋白稳定性也不高,建议考虑更换促溶标签或尝试更换真核表达系统。
10、抗体亚型能够更换吗?
答:可以的,不过一般亚型的更换涉及到抗体骨架结构的改变,有可能会影响抗体的表达量及亲和力。
11、有靶点信息,但是想找下市面上是否有已知的抗体序列公布,然后做重组表达?
答:我们可以帮客户查找数据库,然后评估看是否有合适的符合老师应用的抗体序列。
12、表达失败怎么收费?
答:失败判定标准:交付以PAGE检测有目的条带为准。针对蛋白可能存在降解的情况,因为降解与蛋白本身特性相关,表达方案无法完全完全避免,在实验时会尽量优化,但无法保证蛋白无降解。针对包涵体问题,因为包涵体也是蛋白在体内存在的一种形式,因此包涵体形式也符合交付标准。若以上情况都未达到,判定项目失败,我们跟老师承担一半表达测试费用,老师只需支付基因合成+载体构建+50%表达测试费用,剩余50%表达测试费用老师不用支付。
13、蛋白是跨膜蛋白,想表达全长?
答:一般跨膜蛋白的整体疏水性很高,全长表达难度非常高,就算有表达,表达量也不会太大,因为细胞膜面积有限,不足支撑过多膜蛋白发附着,另外后期的纯化得率也很低。我们技术同事可以根据老师蛋白后期应用序列进行分析,评估胞内或胞外的截短表达涉及,因为一般膜蛋白发挥作用主要依赖胞外区或胞内区结构域,不一会非要采用全长蛋白表达,若仍需要考虑表达全长,建议选择无细胞表达系统尝试。
14、大肠酵母昆虫哺乳表达都能做吗?
答:都能做,目前这些技术平台我们公司都具备,但考虑到平台表达成功率和性价比的优化,目前我们主要对接原核大肠杆菌和真核哺乳细胞表达平台,其他平台因为费用和周期都比较高,所以现在市面上也在慢慢淘汰。
15、直接提供表达质粒,可以做吗?
答:可以做,一般这种需要老师提供质粒构建图谱和测序文件,我们确认没问题可以进行表达测试,若表达失败,仍需要收取表达测试尾款。所以建议老师由我们来合成构建表达载体,因为我们通常会统一和标签一起进行密码子优化合成,增加表达成功率。
16、大的融合标签对蛋白活性有影响吗?
答:一般不会有影响,因为目前采用的大融合标签都是经过长时间的摸索确定的,像Fc这种标签,也是很多药企在开发功能活性蛋白中常用的,之前我们做了200多种不同靶标的Fc标签蛋白配受体互作测试,发现活性数据都不会受标签影响。
17、重组表达宣传单页?
答:可以查看>技术资源>资料下载。